Virologie hoorcolleges – deel 2
HC 21&22: regulatie van translatie
- Eukaryote mRNAs zijn monocistronic en hebben allemaal een cap.
o Monocistronic: bijna alle mRNAs coderen voor maar één open reading frame (ORF).
o Veel uitzonderingen voor virussen
- Virussen coderen geen componenten van de translatie machinerie.
o Uitzonderingen: sommige virussen in algen (unicellulaire prokaryoten).
- Ribosomen en tRNA
o Ribosomen van eukaryoten heten het 80S ribosoom.
▪ Opgebouwd uit 40S subunit (bevat het 18S rRNA) en de 60S subunit (bevat
drie verschillende rRNAs).
▪ De ribosomale RNAs zijn vrijwel allemaal betrokken bij de stabilisatie van de
complexen.
▪ De S-waarde slaat indirect op de grootte: Svedberg units: wordt bepaald
door de sedimentatie coëfficiënt: afhankelijk van de massa, vorm en
dichtheid.
o tRNAs:
▪ Er zijn 20 aminozuren en daarvoor zijn 61 codons (+3 stopcodons).
▪ Er zijn maar 40-60 verschillende tRNAs in de cel. Dit komt omdat de tRNAs in
de eerste positie van hun tRNA anticodon een wobbel positie hebben.
• Wobbel positie: op deze positie kan er ook een mis-basepaar
gevormd worden.
▪ Sommige tRNAs hybridiseren dus met een niet-perfect codon waardoor er
minder tRNAs dan codons zijn.
▪ Aminoacyl-tRNA synthetases zetten het juiste aminozuur aan het tRNA.
• De aminoacyl-tRNA synthetases zijn ook weer specifiek voor de
verschillende tRNAs.
▪ De tRNAs hebben een sterk geconserveerde structuur. Vooral het anticodon
bepaalt dus welk aminozuur wordt ingebouwd.
▪ Vele baseparingen geven een stabiele structuur van het tRNA.
▪ Veel nucleotiden zijn gemodificeerd:
• DHU: dihydroxyuridine
• mG: methylguanosine
• mA: methyladenosine
• mC: methylcytosine
• ψ: pseudouridine
~1~
, ▪ De linker positie in het anticodon (zie afbeelding) is altijd gemethyleerd.
- Functionele unit van translatie: het polyribosoom.
o De structuur van een RNA die getransleerd wordt, ziet eruit als een polyribosoom.
▪ Polyribosoom: de 40S en 60S subunit assembleren op de initiatie site →
scannen → translatie vanaf startcodon. Zodra deze ribosomen bezig zijn,
start er al een volgend ribosoom → het RNA is volledig gevuld met
ribosomen. Dit geeft een hele grote structuur (groter dan een virus).
o Circularisatie van het mRNA door associatie van de cap met pAbp.
▪ Functie: na het stopcodon op het mRNA kan de 40S subunit hierdoor direct
opstappen en kan de translatie opnieuw beginnen → verhoogde efficiëntie
van translatie.
- Stappen van translatie:
o Associatie van het pre-initiatie complex met de cap.
▪ Het pre-initiatie complex is gebonden aan de 40S subunit van het ribosoom.
▪ Aan het initiatiecomplex is altijd tRNA met een methionine gebonden. Dit is
namelijk het eerste aminozuur dat wordt ingebouwd.
o Scanning tot het AUG startcodon.
o Initiatie van translatie op het startcodon → elongatie.
o Terminatie van polypeptide synthese op het stopcodon.
▪ Release factor is bij terminatie betrokken: dit is een eiwit (i.p.v. een RNA)
dat aan het ribosoom bindt → disassemblage van het ribosoom en recycling
van de componenten.
• Deze recycling is extra efficiënt door circularisatie van het mRNA
(door pAbp).
~2~
,- Stappen van assemblage:
o Formatie en vervolgens associatie van twee complexen:
▪ eIF1a en eIF3 binden aan het 40S ribosomale subunit: hiermee voorkomen
dat 60S bindt.
• eIF = eukaryotic initiation factor.
▪ eIF2-GTP, eIF1 en Met-tRNA (voor het startcodon) vormen het ternaire
complex.
▪ Bovenstaande complexen vormen samen het 43S pre-initiatie complex.
o Vervolgens twee opties:
▪ Optie 1: onafhankelijk cap-bindend complex vormen (eIF4F).
• eIF4F is dus geen afzonderlijke factor maar een assembly van drie
afzonderlijke initiatiefactoren: eIF4E (=cap-bindend eiwit), eIF4G en
eIF4A (=helicase).
▪ Optie 2: componenten van eIF4F binden direct (los van elkaar) op het 43S
pre-initiatie complex:
• eIF4G bindt aan het complex via eIF3 → rekrutering van eIF4A.
• eIFE bindt aan de cap van het mRNA.
• eIF4G bindt aan eIF4E en rekruteert daarmee 40S naar de cap.
• mRNA interacteert met Met-tRNA en de 40S subunit.
▪ Cruciaal voor initiatie: de eIF4E subunit: start de cap-afhankelijke translatie
door te binden aan de cap.
o Fosforylatie van eIF4E door Mnk1/2 (gerekruteerd door eIF4G) → translatie-initiatie
wordt verhoogd.
▪ Dit is een belangrijk punt van regulatie. Optie 2
Optie 1
Ternaire
complex
- Functie van de eukaryote initiatiefactoren (eIF):
o eIF1: herkent het initiatie codon.
o eIF1a: bindt aan 40S (later ook aan 60S): betrokken bij scanning.
o eIF2: bindt Met-tRNA (dit is een GTP-ase).
o eIF3: bindt aan 40S: neemt deel in alle fasen.
▪ eIF3 is een groot complex: bestaat uit 13 subunits, 800kD.
o eIF4G is de centrale ‘hub’ waarop het initiatiecomplex gevormd wordt. eIF4G is een
scaffold eiwit door de volgende eiwitten te verbinden:
▪ eIF4E: bindt aan de cap
▪ Pabp: polyA-binding protein (3’ einde)
~3~
, ▪ Mnk1/2: eIF4E kinase
• Fosforyleert serine-209.
▪ eIF4A: helicase
▪ eIF3: bindt zelf weer aan 40S
o eIF4G is een belangrijke target voor virussen: bv poliovirus knipt met zijn 2A
protease eIF4G waardoor de interactie met eIF4E verloren gaat → translatie (van
gastheer) wordt stilgelegd.
- Zodra het initiatiecomplex is gevormd, begint 40S het mRNA te scannen vanaf de cap voor
het startcodon.
o eIF4A ontwindt de 5’UTR (ATP-afhankelijk helicase).
o De eerste AUG is (in principe) het startcodon.
▪ eIF1 en eIF1a herkennen het AUG codon.
o GTP gebonden aan eIF2 wordt gehydrolyseerd na herkenning van het startcodon en
start synthese.
▪ Hydrolyse wordt geactiveerd door eIF5, een GAP.
▪ eIF2 trekt Met-tRNA naar het complex.
o Na hydrolyse dissociëren de eIF eiwitten.
o Nu kan de 60S ribosomale subunit associëren met het 40S subunit → methionine
wordt op de goede plek gezet → translatie begint.
- De translatie begint op het AUG startcodon.
o Rond het startcodon ligt een geconserveerde sequentie: dit is de Kozak
consensussequentie.
o In principe kan elke AUG gebruikt worden als startcodon maar afhankelijk van de
conservering van deze consensussequentie gebeurt dit niet altijd → scanning gaat
verder.
~4~
HC 21&22: regulatie van translatie
- Eukaryote mRNAs zijn monocistronic en hebben allemaal een cap.
o Monocistronic: bijna alle mRNAs coderen voor maar één open reading frame (ORF).
o Veel uitzonderingen voor virussen
- Virussen coderen geen componenten van de translatie machinerie.
o Uitzonderingen: sommige virussen in algen (unicellulaire prokaryoten).
- Ribosomen en tRNA
o Ribosomen van eukaryoten heten het 80S ribosoom.
▪ Opgebouwd uit 40S subunit (bevat het 18S rRNA) en de 60S subunit (bevat
drie verschillende rRNAs).
▪ De ribosomale RNAs zijn vrijwel allemaal betrokken bij de stabilisatie van de
complexen.
▪ De S-waarde slaat indirect op de grootte: Svedberg units: wordt bepaald
door de sedimentatie coëfficiënt: afhankelijk van de massa, vorm en
dichtheid.
o tRNAs:
▪ Er zijn 20 aminozuren en daarvoor zijn 61 codons (+3 stopcodons).
▪ Er zijn maar 40-60 verschillende tRNAs in de cel. Dit komt omdat de tRNAs in
de eerste positie van hun tRNA anticodon een wobbel positie hebben.
• Wobbel positie: op deze positie kan er ook een mis-basepaar
gevormd worden.
▪ Sommige tRNAs hybridiseren dus met een niet-perfect codon waardoor er
minder tRNAs dan codons zijn.
▪ Aminoacyl-tRNA synthetases zetten het juiste aminozuur aan het tRNA.
• De aminoacyl-tRNA synthetases zijn ook weer specifiek voor de
verschillende tRNAs.
▪ De tRNAs hebben een sterk geconserveerde structuur. Vooral het anticodon
bepaalt dus welk aminozuur wordt ingebouwd.
▪ Vele baseparingen geven een stabiele structuur van het tRNA.
▪ Veel nucleotiden zijn gemodificeerd:
• DHU: dihydroxyuridine
• mG: methylguanosine
• mA: methyladenosine
• mC: methylcytosine
• ψ: pseudouridine
~1~
, ▪ De linker positie in het anticodon (zie afbeelding) is altijd gemethyleerd.
- Functionele unit van translatie: het polyribosoom.
o De structuur van een RNA die getransleerd wordt, ziet eruit als een polyribosoom.
▪ Polyribosoom: de 40S en 60S subunit assembleren op de initiatie site →
scannen → translatie vanaf startcodon. Zodra deze ribosomen bezig zijn,
start er al een volgend ribosoom → het RNA is volledig gevuld met
ribosomen. Dit geeft een hele grote structuur (groter dan een virus).
o Circularisatie van het mRNA door associatie van de cap met pAbp.
▪ Functie: na het stopcodon op het mRNA kan de 40S subunit hierdoor direct
opstappen en kan de translatie opnieuw beginnen → verhoogde efficiëntie
van translatie.
- Stappen van translatie:
o Associatie van het pre-initiatie complex met de cap.
▪ Het pre-initiatie complex is gebonden aan de 40S subunit van het ribosoom.
▪ Aan het initiatiecomplex is altijd tRNA met een methionine gebonden. Dit is
namelijk het eerste aminozuur dat wordt ingebouwd.
o Scanning tot het AUG startcodon.
o Initiatie van translatie op het startcodon → elongatie.
o Terminatie van polypeptide synthese op het stopcodon.
▪ Release factor is bij terminatie betrokken: dit is een eiwit (i.p.v. een RNA)
dat aan het ribosoom bindt → disassemblage van het ribosoom en recycling
van de componenten.
• Deze recycling is extra efficiënt door circularisatie van het mRNA
(door pAbp).
~2~
,- Stappen van assemblage:
o Formatie en vervolgens associatie van twee complexen:
▪ eIF1a en eIF3 binden aan het 40S ribosomale subunit: hiermee voorkomen
dat 60S bindt.
• eIF = eukaryotic initiation factor.
▪ eIF2-GTP, eIF1 en Met-tRNA (voor het startcodon) vormen het ternaire
complex.
▪ Bovenstaande complexen vormen samen het 43S pre-initiatie complex.
o Vervolgens twee opties:
▪ Optie 1: onafhankelijk cap-bindend complex vormen (eIF4F).
• eIF4F is dus geen afzonderlijke factor maar een assembly van drie
afzonderlijke initiatiefactoren: eIF4E (=cap-bindend eiwit), eIF4G en
eIF4A (=helicase).
▪ Optie 2: componenten van eIF4F binden direct (los van elkaar) op het 43S
pre-initiatie complex:
• eIF4G bindt aan het complex via eIF3 → rekrutering van eIF4A.
• eIFE bindt aan de cap van het mRNA.
• eIF4G bindt aan eIF4E en rekruteert daarmee 40S naar de cap.
• mRNA interacteert met Met-tRNA en de 40S subunit.
▪ Cruciaal voor initiatie: de eIF4E subunit: start de cap-afhankelijke translatie
door te binden aan de cap.
o Fosforylatie van eIF4E door Mnk1/2 (gerekruteerd door eIF4G) → translatie-initiatie
wordt verhoogd.
▪ Dit is een belangrijk punt van regulatie. Optie 2
Optie 1
Ternaire
complex
- Functie van de eukaryote initiatiefactoren (eIF):
o eIF1: herkent het initiatie codon.
o eIF1a: bindt aan 40S (later ook aan 60S): betrokken bij scanning.
o eIF2: bindt Met-tRNA (dit is een GTP-ase).
o eIF3: bindt aan 40S: neemt deel in alle fasen.
▪ eIF3 is een groot complex: bestaat uit 13 subunits, 800kD.
o eIF4G is de centrale ‘hub’ waarop het initiatiecomplex gevormd wordt. eIF4G is een
scaffold eiwit door de volgende eiwitten te verbinden:
▪ eIF4E: bindt aan de cap
▪ Pabp: polyA-binding protein (3’ einde)
~3~
, ▪ Mnk1/2: eIF4E kinase
• Fosforyleert serine-209.
▪ eIF4A: helicase
▪ eIF3: bindt zelf weer aan 40S
o eIF4G is een belangrijke target voor virussen: bv poliovirus knipt met zijn 2A
protease eIF4G waardoor de interactie met eIF4E verloren gaat → translatie (van
gastheer) wordt stilgelegd.
- Zodra het initiatiecomplex is gevormd, begint 40S het mRNA te scannen vanaf de cap voor
het startcodon.
o eIF4A ontwindt de 5’UTR (ATP-afhankelijk helicase).
o De eerste AUG is (in principe) het startcodon.
▪ eIF1 en eIF1a herkennen het AUG codon.
o GTP gebonden aan eIF2 wordt gehydrolyseerd na herkenning van het startcodon en
start synthese.
▪ Hydrolyse wordt geactiveerd door eIF5, een GAP.
▪ eIF2 trekt Met-tRNA naar het complex.
o Na hydrolyse dissociëren de eIF eiwitten.
o Nu kan de 60S ribosomale subunit associëren met het 40S subunit → methionine
wordt op de goede plek gezet → translatie begint.
- De translatie begint op het AUG startcodon.
o Rond het startcodon ligt een geconserveerde sequentie: dit is de Kozak
consensussequentie.
o In principe kan elke AUG gebruikt worden als startcodon maar afhankelijk van de
conservering van deze consensussequentie gebeurt dit niet altijd → scanning gaat
verder.
~4~
