Lesdoelen les 5.1
1. De student kan uitleggen welke diverse technieken nodig zijn voor het maken en toepassen
van plasmide-constructen en hoe deze worden toegepast in onderzoek naar cellulaire
functies.
Golden Gate klonering
Bij Golden Gate klonering kan in principe elk stuk DNA aan elk ander stuk DNA geligeerd worden,
want er kan zelf gekozen worden welke overhang gecreëerd wordt. Dit kan d.m.v. PCR worden
gedaan als de restrictie-sites zich niet in het DNA bevinden.
Type IIs restrictie-enzymen (5 bp herkenningssite) knippen naast de herkenningssite en er ontstaan
geen scars. Omdat zelf de overhang wordt bepaald kunnen meerdere fragmenten tegelijk worden
gekloneerd. De herkenningssites moeten voor de RE en bij voorkeur niet in het eindproduct.
Ook mogen er geen polymerases aanwezig zijn, omdat deze kunnen blunten en hierdoor de
fragmenten op iedere plek in elke oriëntatie geligeerd kunnen worden.
Voorbeeld van een restrictie site die vaak gebruikt word is BsaI/BbsI en het is verstandig om geen
restrictie enzymen te kiezen die in 2+ sites knippen.
In de primer: fantasiestukje (4bp)-BsaI site-extra overhang (4bp)
Zodra polymerase de exonuclease inhaalt begint de DNA ligase en dit kan de uiteinden aan elkaar
ligeren. Het proces werkt alleen bij cirkels dus plasmiden.
Gibson klonering
Gibson Cloning maakt geen gebruik van restrictiesites. Er wordt gebruik gemaakt van een 5`-> 3`
nuclease (T5 exonuclease). Deze verwijdert vanaf de 5` kant steeds basen. Je krijgt dan een 5`
teruggetrokken (retracted) uiteinde. Je kunt het ook beschrijven als een 3` uitstekend uiteinde.
Wanneer twee DNA fragmenten gelijke sequenties bevatten maar aan verschillende uiteinden (de
één links en de ander rechts) dan ontstaat er een situatie waarbij de bovenste streng van de een (3`
overhang) past, en dus annealt, op de onderste streng van de ander (ook 3` overhang!). Op dat
moment komt een polymerase in actie. Deze moet sneller aanvullen dan dat de exonuclease af-eet!
Hij moet deze namelijk inhalen! Zodra hij de plaats waar de exonuclease bezig is heeft bereikt, kan
een derde enzym, de ligase de uiteinden aan elkaar ligeren. Vanaf dat moment zijn zowel de
exonuclease als de polymerase op die plaats uitgewerkt.
1. De student kan uitleggen welke diverse technieken nodig zijn voor het maken en toepassen
van plasmide-constructen en hoe deze worden toegepast in onderzoek naar cellulaire
functies.
Golden Gate klonering
Bij Golden Gate klonering kan in principe elk stuk DNA aan elk ander stuk DNA geligeerd worden,
want er kan zelf gekozen worden welke overhang gecreëerd wordt. Dit kan d.m.v. PCR worden
gedaan als de restrictie-sites zich niet in het DNA bevinden.
Type IIs restrictie-enzymen (5 bp herkenningssite) knippen naast de herkenningssite en er ontstaan
geen scars. Omdat zelf de overhang wordt bepaald kunnen meerdere fragmenten tegelijk worden
gekloneerd. De herkenningssites moeten voor de RE en bij voorkeur niet in het eindproduct.
Ook mogen er geen polymerases aanwezig zijn, omdat deze kunnen blunten en hierdoor de
fragmenten op iedere plek in elke oriëntatie geligeerd kunnen worden.
Voorbeeld van een restrictie site die vaak gebruikt word is BsaI/BbsI en het is verstandig om geen
restrictie enzymen te kiezen die in 2+ sites knippen.
In de primer: fantasiestukje (4bp)-BsaI site-extra overhang (4bp)
Zodra polymerase de exonuclease inhaalt begint de DNA ligase en dit kan de uiteinden aan elkaar
ligeren. Het proces werkt alleen bij cirkels dus plasmiden.
Gibson klonering
Gibson Cloning maakt geen gebruik van restrictiesites. Er wordt gebruik gemaakt van een 5`-> 3`
nuclease (T5 exonuclease). Deze verwijdert vanaf de 5` kant steeds basen. Je krijgt dan een 5`
teruggetrokken (retracted) uiteinde. Je kunt het ook beschrijven als een 3` uitstekend uiteinde.
Wanneer twee DNA fragmenten gelijke sequenties bevatten maar aan verschillende uiteinden (de
één links en de ander rechts) dan ontstaat er een situatie waarbij de bovenste streng van de een (3`
overhang) past, en dus annealt, op de onderste streng van de ander (ook 3` overhang!). Op dat
moment komt een polymerase in actie. Deze moet sneller aanvullen dan dat de exonuclease af-eet!
Hij moet deze namelijk inhalen! Zodra hij de plaats waar de exonuclease bezig is heeft bereikt, kan
een derde enzym, de ligase de uiteinden aan elkaar ligeren. Vanaf dat moment zijn zowel de
exonuclease als de polymerase op die plaats uitgewerkt.
