Tentamen moleculaire biologie
Y2H
Eiwit-eiwit interacties zijn essentieel voor bijna alle cellulaire processen. Door te
onderzoeken welke eiwitten met elkaar interageren, kunnen we afleiden in welke
processen een specifiek eiwit betrokken is, omdat eiwitten vaak samenwerken in
complexe netwerken.
Een gangbare methode om zulke interacties te bestuderen is het yeast two-
hybrid (Y2H) systeem. Het systeem maakt gebruik van een Gal4-
transcriptiefactor die bestaat uit twee domeinen:
-DNA-bindingsdomein (BD): bindt aan specifieke promotors in het DNA.
-Activatiedomein (AD): zorgt ervoor dat transcriptie van een gen daadwerkelijk
plaatsvindt.
Alleen wanneer BD en AD fysiek samenkomen in hetzelfde eiwitcomplex, wordt
de transcriptie geactiveerd. Ze hoeven dus niet in hetzelfde eiwit aanwezig te
zijn, maar moeten wel in hetzelfde complex zitten.
Om interacties te testen, maken we fusie-eiwitten:
-Plasmide 1: Fusie van Gal4-BD met een “doelwit-eiwit” (bijvoorbeeld Rad24,
Spl2, RNR4 of andere geselecteerde eiwitten). Dit noemen we het BD-fusie-eiwit.
-Plasmide 2: Fusie van Gal4-AD met het 14-3-3 eiwit BMH2, dat dient als bait. Het
AD-fusie-eiwit kan alleen transcriptie activeren als het via BMH2 een interactie
aangaat met een BD-fusie-eiwit.
Als BMH2 (AD-fusie) bindt aan het doelwit-eiwit (BD-fusie), komen BD en AD
fysiek dicht bij elkaar en wordt de GAL1-promoter geactiveerd. Achter de GAL1-
promoter staat het reporter-gen HIS3, dat nodig is voor histidine-synthese.
Hierdoor kan de gistcel groeien op medium zonder histidine.
Als er geen interactie is, wordt HIS3 niet gemaakt en sterven de gistcellen op
medium zonder histidine.
-Wel groei op platen zonder HIS3 -> eiwitten gaan interactie aan
-Geen groei op platen zonder HIS3 -> eiwitten gaan geen interactie aan
Om zeker te weten dat de gistcellen beide plasmiden dragen, bevatten de
plasmiden ook selectiegenen:
TRP1 op het BD-fusie plasmide
LEU2 op het AD-fusie plasmide
Gistcellen die beide plasmiden hebben, kunnen groeien op medium zonder
tryptofaan en leucine. Dit functioneert als plasmidecontrole: alleen cellen die
beide fusie-eiwitten dragen, kunnen groeien op platen zonder leucine en
trypofaan.
We kunnen dit niet zomaar in iedere gistcel doen. Een normale gistcel kan TPR1,
LEU2 en HIS3 zelf maken. We gebruiken gisten waarvan die drie genen
uitgeschakeld zijn (tpr1,leu2,his3).
Een MCS of polylinker is een kort stuk DNA in het plasmide met veel
opeenvolgende restrictie-enzym herkenningsplaatsen. Deze herkenningsplaatsen
,zijn palindromen, dat wil zeggen DNA-sequenties die van 5’ → 3’ op beide
strengen hetzelfde zijn in spiegelbeeld.
5’–GAATTC–3’
3’–CTTAAG–5’
Een restrictie-enzym herkent precies zo’n palindroom en knipt daar het DNA.
Wij willen een fusie-eiwit maken. Een fusie-eiwit ontstaat door twee genen achter
elkaar te zetten, bijvoorbeeld: Gal4-BD + Rad24
DNA wordt afgelezen in triplets (codons), waarbij elk codon één aminozuur
codeert. We moeten ervoor zorgen dat ons reading frame kloppend blijft.
Reading frame: de juiste volgorde van triplets vanaf het startcodon (ATG).
Als de insert (Rad24) niet exact aansluit op het einde van Gal4-BD in een
veelvoud van 3 basen, ontstaat een frameshift. Dus het aantal basen tussen
Gal4-BD en Rad24 moet een veelvoud van 3 zijn.
Verder zijn er drie stopcodons: TAA, TAG, TGA. Je kunt ervoor kiezen om zelf een
stopcodon in te voegen dan laat je de transcriptie stoppen na jou insert. Of je
kiest ervoor om de stopcodon van de vector te volgen, dan zullen er wat extra
aminozuren worden toegevoegd maar dat heeft geen invloed op jouw eiwit.
Je gebruikt PCR om het DNA van je gen (bijv. Rad24) te vermeerderen. Bij het
ontwerp van PCR-primers kun je extra sequenties toevoegen, dit is nodig voor
bijvoorbeeld. Restrictie-enzym herkenningsplaatsen toe te voegen (palindromen)
om het product later te knippen en in de plasmide te plakken. Of eventueel extra
nucleotiden zodat de insert in frame aansluit met de vector.
14-3-3 eiwitten
Ons fusie-eiwit is het BAMH-2 eiwit. BMH-2 is een 14-3-3 eiwit. Dat is een
bepaalde categorie familie eiwitten en zitten in allerlei dingen. Ze zijn betrokken
bij heel veel functies in de cel en komen vaak voor in dimeren.
Vaak is een binding aan een 14-3-3 eiwit nodig om een andere taak te kunnen
vervullen zoals fosforylatie, interactie met andere eiwitten, lokalisatie of
apoptose.
Ze beïnvloeden ook andere eiwit-eiwit interacties. Bijvoorbeeld het blokkeren van
een interactie met een ander eiwit. Andersom kan het ook zijn dat juist het 14-3-
3 eiwit ervoor zorgt dat twee andere eiwitten met elkaar kunnen binden.
Kloneren
Restrictie enzymen komen origineel uit bacterie. Bacteriën gebruiken die
restrictie enzymen om vreemd DNA te knippen. Om te zorgen dat de bacterie zijn
eigen DNA niet te knippen zorgt hij ervoor dat zijn eigen DNA gemodificeerd is
(gemethyleerd), dan kan de enzymen niet knippen.
De restrictie enzymen kunnen blund-ends en sticky-ends opleveren.
-Type II stickey-ends (5’uiteinde): enkele streng overhang aan het 5’-uiteinde
van het DNA ontstaat. Dit betekent dat de 5’-kant van de streng enkele
nucleotiden “uitsteken”
-Type II stickey-ends (3’uiteinde): enkele streng overhang aan het 3’-uiteinde
ontstaat. De 3’-kant van de streng steekt enkele nucleotiden uit,
, -Type II blund-ends: worden precies tussen twee basen geknipt, waardoor
rechte uiteinden ontstaan.
-Type IIs blund-ends: worden op een vaste afstand van hun herkenningsplaats
geknipt, dit kan zowel blund-ends als stickey-ends opleveren.
Met een blund uiteinde heb je weinig invloed op hoe jou stukje DNA terecht komt,
daarom gebruiken we het niet bij kloneren. Bij PCR wel.
Tentamenvraag: we hebben een bepaald enzym en die knipt in palendroom
GAATTC en die knipt op de plaats van het pijltje. Ontstaan er sticky uiteinde en
kunnen die later aan elkaar geplakt worden? Om op elkaar te kunnen passen wil
je ervoor zorgen dat het uiteinde van de een moet kunnen plakken op het andere
uiteinde, ze moeten complementair zijn.
Wanneer je 1 restrictie-enzym laat knippen, zowel je vector als je insert, dan
kunnen er meerdere dingen mis gaan. Het fragment kan op twee verschillende
manieren in jou vector terecht komen terwijl wij hem maar in 1 bepaalde
oriëntatie willen hebben. Verder kunnen er ook twee of meer fragmenten in onze
vector terecht komen.
Om dit te voorkomen kunnen we twee verschillende restrictie enzymen
gebruiken. Dus de ene enzym knipt de bovenste streng en de ander knipt de
andere streng. In je plasmide en ook in je gen van interesse. Hierdoor kan jouw
fragment eigenlijk maar op 1 manier jouw vector in.
Vervolgens gaan we ligeren, dit doen we met T4-ligase enzymen. De stick-ends
worden aan elkaar geplakt. We hebben hiervoor ook een bepaalde tempratuur
nodig. Zorg ervoor dat je de tempratuur zo instelt dat jouw enzym het beste
functioneert.
T4-ligase gebruikt ATP om zichzelf tijdelijk te activeren. Het enzym bindt ATP en
vormt ligase-AMP, waarbij AMP covalent aan het enzym gebonden wordt. Ligase-
AMP bindt vervolgens aan het 5'-fosfaat van het DNA, het fosfaat van het DNA is
nu gekoppeld aan AMP. Het 3'-hydroxyl uiteinde van het aangrenzende DNA
fragment valt het fosfaat aan. Hierdoor ontstaat een binding tussen het 3'-OH
van het ene fragment en het 5'-fosfaat van het andere fragment. Het AMP wordt
vrijgegeven, het enzym wordt hersteld en kan opnieuw een ligatie uitvoeren.
Om ervoor te zorgen dat onze vector niet aan elkaar ligeert zonder de insert
ertussen. Gaan we de vector defosforyleren. De fosfaatgroep valt door fosfatase
van de uiteinde van de plasmide af waardoor de sticky-ends van de plasmide niet
aan elkaar kunnen plakken. Als je zorgt dat je gen wel die fosfaat groep heeft dan
kunnen ze die gewoon gebruiken om dat gen in je plasmide te plakken.
Y2H
Eiwit-eiwit interacties zijn essentieel voor bijna alle cellulaire processen. Door te
onderzoeken welke eiwitten met elkaar interageren, kunnen we afleiden in welke
processen een specifiek eiwit betrokken is, omdat eiwitten vaak samenwerken in
complexe netwerken.
Een gangbare methode om zulke interacties te bestuderen is het yeast two-
hybrid (Y2H) systeem. Het systeem maakt gebruik van een Gal4-
transcriptiefactor die bestaat uit twee domeinen:
-DNA-bindingsdomein (BD): bindt aan specifieke promotors in het DNA.
-Activatiedomein (AD): zorgt ervoor dat transcriptie van een gen daadwerkelijk
plaatsvindt.
Alleen wanneer BD en AD fysiek samenkomen in hetzelfde eiwitcomplex, wordt
de transcriptie geactiveerd. Ze hoeven dus niet in hetzelfde eiwit aanwezig te
zijn, maar moeten wel in hetzelfde complex zitten.
Om interacties te testen, maken we fusie-eiwitten:
-Plasmide 1: Fusie van Gal4-BD met een “doelwit-eiwit” (bijvoorbeeld Rad24,
Spl2, RNR4 of andere geselecteerde eiwitten). Dit noemen we het BD-fusie-eiwit.
-Plasmide 2: Fusie van Gal4-AD met het 14-3-3 eiwit BMH2, dat dient als bait. Het
AD-fusie-eiwit kan alleen transcriptie activeren als het via BMH2 een interactie
aangaat met een BD-fusie-eiwit.
Als BMH2 (AD-fusie) bindt aan het doelwit-eiwit (BD-fusie), komen BD en AD
fysiek dicht bij elkaar en wordt de GAL1-promoter geactiveerd. Achter de GAL1-
promoter staat het reporter-gen HIS3, dat nodig is voor histidine-synthese.
Hierdoor kan de gistcel groeien op medium zonder histidine.
Als er geen interactie is, wordt HIS3 niet gemaakt en sterven de gistcellen op
medium zonder histidine.
-Wel groei op platen zonder HIS3 -> eiwitten gaan interactie aan
-Geen groei op platen zonder HIS3 -> eiwitten gaan geen interactie aan
Om zeker te weten dat de gistcellen beide plasmiden dragen, bevatten de
plasmiden ook selectiegenen:
TRP1 op het BD-fusie plasmide
LEU2 op het AD-fusie plasmide
Gistcellen die beide plasmiden hebben, kunnen groeien op medium zonder
tryptofaan en leucine. Dit functioneert als plasmidecontrole: alleen cellen die
beide fusie-eiwitten dragen, kunnen groeien op platen zonder leucine en
trypofaan.
We kunnen dit niet zomaar in iedere gistcel doen. Een normale gistcel kan TPR1,
LEU2 en HIS3 zelf maken. We gebruiken gisten waarvan die drie genen
uitgeschakeld zijn (tpr1,leu2,his3).
Een MCS of polylinker is een kort stuk DNA in het plasmide met veel
opeenvolgende restrictie-enzym herkenningsplaatsen. Deze herkenningsplaatsen
,zijn palindromen, dat wil zeggen DNA-sequenties die van 5’ → 3’ op beide
strengen hetzelfde zijn in spiegelbeeld.
5’–GAATTC–3’
3’–CTTAAG–5’
Een restrictie-enzym herkent precies zo’n palindroom en knipt daar het DNA.
Wij willen een fusie-eiwit maken. Een fusie-eiwit ontstaat door twee genen achter
elkaar te zetten, bijvoorbeeld: Gal4-BD + Rad24
DNA wordt afgelezen in triplets (codons), waarbij elk codon één aminozuur
codeert. We moeten ervoor zorgen dat ons reading frame kloppend blijft.
Reading frame: de juiste volgorde van triplets vanaf het startcodon (ATG).
Als de insert (Rad24) niet exact aansluit op het einde van Gal4-BD in een
veelvoud van 3 basen, ontstaat een frameshift. Dus het aantal basen tussen
Gal4-BD en Rad24 moet een veelvoud van 3 zijn.
Verder zijn er drie stopcodons: TAA, TAG, TGA. Je kunt ervoor kiezen om zelf een
stopcodon in te voegen dan laat je de transcriptie stoppen na jou insert. Of je
kiest ervoor om de stopcodon van de vector te volgen, dan zullen er wat extra
aminozuren worden toegevoegd maar dat heeft geen invloed op jouw eiwit.
Je gebruikt PCR om het DNA van je gen (bijv. Rad24) te vermeerderen. Bij het
ontwerp van PCR-primers kun je extra sequenties toevoegen, dit is nodig voor
bijvoorbeeld. Restrictie-enzym herkenningsplaatsen toe te voegen (palindromen)
om het product later te knippen en in de plasmide te plakken. Of eventueel extra
nucleotiden zodat de insert in frame aansluit met de vector.
14-3-3 eiwitten
Ons fusie-eiwit is het BAMH-2 eiwit. BMH-2 is een 14-3-3 eiwit. Dat is een
bepaalde categorie familie eiwitten en zitten in allerlei dingen. Ze zijn betrokken
bij heel veel functies in de cel en komen vaak voor in dimeren.
Vaak is een binding aan een 14-3-3 eiwit nodig om een andere taak te kunnen
vervullen zoals fosforylatie, interactie met andere eiwitten, lokalisatie of
apoptose.
Ze beïnvloeden ook andere eiwit-eiwit interacties. Bijvoorbeeld het blokkeren van
een interactie met een ander eiwit. Andersom kan het ook zijn dat juist het 14-3-
3 eiwit ervoor zorgt dat twee andere eiwitten met elkaar kunnen binden.
Kloneren
Restrictie enzymen komen origineel uit bacterie. Bacteriën gebruiken die
restrictie enzymen om vreemd DNA te knippen. Om te zorgen dat de bacterie zijn
eigen DNA niet te knippen zorgt hij ervoor dat zijn eigen DNA gemodificeerd is
(gemethyleerd), dan kan de enzymen niet knippen.
De restrictie enzymen kunnen blund-ends en sticky-ends opleveren.
-Type II stickey-ends (5’uiteinde): enkele streng overhang aan het 5’-uiteinde
van het DNA ontstaat. Dit betekent dat de 5’-kant van de streng enkele
nucleotiden “uitsteken”
-Type II stickey-ends (3’uiteinde): enkele streng overhang aan het 3’-uiteinde
ontstaat. De 3’-kant van de streng steekt enkele nucleotiden uit,
, -Type II blund-ends: worden precies tussen twee basen geknipt, waardoor
rechte uiteinden ontstaan.
-Type IIs blund-ends: worden op een vaste afstand van hun herkenningsplaats
geknipt, dit kan zowel blund-ends als stickey-ends opleveren.
Met een blund uiteinde heb je weinig invloed op hoe jou stukje DNA terecht komt,
daarom gebruiken we het niet bij kloneren. Bij PCR wel.
Tentamenvraag: we hebben een bepaald enzym en die knipt in palendroom
GAATTC en die knipt op de plaats van het pijltje. Ontstaan er sticky uiteinde en
kunnen die later aan elkaar geplakt worden? Om op elkaar te kunnen passen wil
je ervoor zorgen dat het uiteinde van de een moet kunnen plakken op het andere
uiteinde, ze moeten complementair zijn.
Wanneer je 1 restrictie-enzym laat knippen, zowel je vector als je insert, dan
kunnen er meerdere dingen mis gaan. Het fragment kan op twee verschillende
manieren in jou vector terecht komen terwijl wij hem maar in 1 bepaalde
oriëntatie willen hebben. Verder kunnen er ook twee of meer fragmenten in onze
vector terecht komen.
Om dit te voorkomen kunnen we twee verschillende restrictie enzymen
gebruiken. Dus de ene enzym knipt de bovenste streng en de ander knipt de
andere streng. In je plasmide en ook in je gen van interesse. Hierdoor kan jouw
fragment eigenlijk maar op 1 manier jouw vector in.
Vervolgens gaan we ligeren, dit doen we met T4-ligase enzymen. De stick-ends
worden aan elkaar geplakt. We hebben hiervoor ook een bepaalde tempratuur
nodig. Zorg ervoor dat je de tempratuur zo instelt dat jouw enzym het beste
functioneert.
T4-ligase gebruikt ATP om zichzelf tijdelijk te activeren. Het enzym bindt ATP en
vormt ligase-AMP, waarbij AMP covalent aan het enzym gebonden wordt. Ligase-
AMP bindt vervolgens aan het 5'-fosfaat van het DNA, het fosfaat van het DNA is
nu gekoppeld aan AMP. Het 3'-hydroxyl uiteinde van het aangrenzende DNA
fragment valt het fosfaat aan. Hierdoor ontstaat een binding tussen het 3'-OH
van het ene fragment en het 5'-fosfaat van het andere fragment. Het AMP wordt
vrijgegeven, het enzym wordt hersteld en kan opnieuw een ligatie uitvoeren.
Om ervoor te zorgen dat onze vector niet aan elkaar ligeert zonder de insert
ertussen. Gaan we de vector defosforyleren. De fosfaatgroep valt door fosfatase
van de uiteinde van de plasmide af waardoor de sticky-ends van de plasmide niet
aan elkaar kunnen plakken. Als je zorgt dat je gen wel die fosfaat groep heeft dan
kunnen ze die gewoon gebruiken om dat gen in je plasmide te plakken.
