Les 1 Genetica: Forensische DNA markers en technologie.
Doelen les 1:
1. Waarom wordt DNA als bewijsmateriaal gebruikt?
2. Wat is DNA?
3. Type forensische markers en de eigenschappen.
4. Gebruikte technieken voor het aantonen van forensische markers.
DNA blijft overal achter. Naast het vinden van DNA en het vaststellen van een overeenkomst
tussen het gevonden DNA en de verdachte, is het bij forensisch onderzoek veel belangrijker
om vast te stellen hoe het DNA op de vindplaats terecht gekomen is.
- DNA fingerprint het DNA profiel van een persoon. (de 1% die niet overeen komt met de
rest van de mensen)
- DNA komt zelden in schone vorm voor, met behulp met PCR kan het DNA toch gebruikt
wordt.
- 99.9% van het DNA komt bij ieder mens overeen.
Sensitiviteit vs. Specificiteit
- Sensitiviteit (gevoeligheid) het
percentage zieke mensen die m.b.v. de
diagnostische test ook als ziek worden
geïdentificeerd.
- Specificiteit percentage van gezonde
mensen waarbij de diagnostische test ook
daadwerkelijk aantoont dat zij niet de ziekte
hebben.
Specificiteit is belangrijker in het forensisch onderzoek omdat je dan kan kijken wie
wel of niet de ziekte heeft en zo kan je al mensen afstrepen.
Toepassingen niet-humaan DNA.
- Bacterieel DNA (in grondmonsters) verdachten linken aan een bepaalde locatie of kijken
waar het lijk heeft gelegen.
- Marihuana DNA (DNA van de cannabisplant) distributie netwerken ontrafelen en klonen
van planten onderzoeken.
- Pollen/ planten testen verdachte linken aan een bepaalde locatie.
- Wildlife forensics DNA van bedreigde planten en dieren onderzoeken.
- Soort identificaties bijvoorbeeld kijken of gevonden botten afkomstig zijn van de mens.
- Testen van huisdieren dierenmishandeling, het linken van een verdachte aan een plaats
delict.
DNA
- Deoxy-ribo-nucleic-acid.
- 2 antiparallel, alfa-helix, complementaire strengen met 4 nucleotides.
- Een nucleotide de base + fosfaatgroep + suikergroep.
- Een backbone zijn de fosfaatgroepen.
- Een base is de
Adenine/Thymine/Cytosine/Guanine.
,Waarom is er een 3’ en een 5’ einde?
- Een keten ontstaat altijd van 3’ naar 5’. (aflezen dus altijd van 3’ naar 5’)
Bij DNA synthese wordt er altijd een nieuw atoom aan de 5’ geplakt.
- Deze einden worden 3’ en 5’ genoemd omdat dit de nummers zijn van de C-atomen.
- Bij RNA kan de T base niet meer goed aanhechten, hierdoor is er een U base ontstaan.
Forensische markers
Er zijn meerdere markers nodig voor het opstellen van een DNA profiel.
- Autosomen alle chromosomen behalve de geslachtschromosomen. (nr. 1 t/m 22)
VNTR (niet-coderend DNA)
STR (niet-coderend DNA)
SNP (niet-coderend en
coderend DNA)
- Y chromosomen mannelijk
geslachtschromosoom.
STR (niet-coderend DNA)
Amelogenine (niet-coderend
DNA)
- Mitochondriaal DNA doorgegeven
DNA van de moeder.
SNP (niet-coderend en coderend DNA)
Veel markers liggen in het niet-coderend DNA, omdat hier de meeste verschillen in zitten. Dit
is omdat dit voor niks codeert, waardoor er niks fout kan gaan in het genoom.
SNP kunnen wel in het coderende DNA zitten je hebt een andere base dan het grootste
deel van de wereldbevolking.
3% van het humane genoom bestaat uit niet-coderend DNA.
Bij DNA onderzoek wordt gekeken naar of iemand een STR heeft (heterozygoot of
homozygoot) en hoe lang deze STR’s zijn.
VNTR’s moeten op andere manieren geanalyseerd worden dan STR’s omdat deze veel langer
zijn.
- Locus de locatie van iets op een bepaald chromosoom (kan voor genen maar ook voor
STR’s)
- Allel een type DNA, number of tendem repeats. (je hebt altijd 2 allelen, pathanaal en
methanaal)
STR’s (Short Tandem Repeats)
- Fragment van 2-6 bp.
- 5-200 herhalingen
- Totaal 10-1000 bp.
- Homozygoot en heterozygoot is mogelijk.
- 3% van het humane genoom is niet coderend DNA en heeft dus geen fenotype -- > dit wordt
gezien als de DNA fingerprint.
- Flanking region (= deel DNA dat aan het 5’ eind van het gen zit) is constant PCR wordt
gebruikt voor de analyse in combinatie met capillaire gel elektroforese.
Y-STR’s
- Gebruikt voor pathanaal onderzoek.
- Dit kan dus alleen maar voor mannen (wordt vaak gebruikt bij zedenzaken)
,VNTR’s (Variable Number of Tandem Repeats)
- Variaties in het aantal herhalingen van een bepaalde DNA sequentie.
- De kortere fragmenten worden geanalyseerd met PCR en gelelektroforese of RFLP analyse.
- Herhaling unit van 8-100 bp.
- 10-1500 herhalingen.
- Totaal 500-20.000 bp.
SNP’s (Single Nucleotide Polymorphisms)
- 1 verschil in de nucleotide. (1 nucleotide is anders)
- > 1% van de populatie heeft dit.
- < 1% wordt het een mutatie genoemd.
- Een SNP is dus eigenlijk een veelvoorkomende mutatie.
- SNP profiling wordt vaak gebruikt voor etniciteit onderzoek.
- SNP’s kunnen ook in je mitochondriaal DNA zitten omdat er simpelweg zo veel
mitochondriaal DNA aanwezig is in elke cel.
Welke technieken worden gebruikt voor welke soort marker?
PCR + capillaire gel elektroforese
- Gel elektroforese met kleurtjes en met een laser worden de nucleotiden in fragmenten
gelezen van de STR’s.
- Scheiden en detecteren van PCR producten van STR’s.
- Analyse van STR’s op basis van grootte en kleur.
- Gebruikt bij kleine hoeveelheden DNA (moet geamplificeerd worden)
- Is minder accuraat, omdat bij het amplificeren de primers je monsters minder goed kunnen
maken.
RFLP (restriction fragment length polymorfisme)
- Stappen voor RFLP:
1. Monster cel.
2. DNA extractie.
3. DNA splitsen m.b.v. restrictie enzym.
4. DNA fragmenten scheiden met elektroforese.
5. Verplaatsen naar een membraan (southern blott)
6. Het binden van radioactieve DNA probe aan specifieke DNA fragmenten.
7. Het membraan van het overige probe afwassen.
, 8. Met behulp van een x-ray wordt het radioactieve patroon bekeken.
9. DNA patroon wordt vergeleken.
- Hierbij wordt er gekeken naar grote afwijkingen in bvb de lengtes van de fragmenten.
- DNA worden geknipt door restrictie enzymen op de plekken van een VNTR.
- Er wordt veel DNA gevonden (50 tot 500 ng gevonden)
- Gedegradeerd DNA kan niet gebruikt worden omdat je geen onderscheid kan maken tussen
geknipte stukjes of kapotte stukjes.
- Dit kost meer geld en duurt langer maar is wel accurater.
Voor- en nadelen van PCR en RFLP
- Hoeveelheid DNA:
o PCR ongeveer 20 kopieën (amplificatie)
o RFLP 50-500 ng nodig.
- Gedegradeerd DNA:
o PCR kleine fragmenten nodig, dus prima.
o RFLP hiervoor heb je hoog moleculaire gewicht van DNA nodig. Gedegradeerd
materiaal kan niet gebruikt worden.
- Bekende Loci:
o PCR (STR) 8-9 STR loci genoeg voor 1: 1,000,000,000 discriminatie.
o RFLP (VNTR) 4-6 VNTR loci genoeg voor 1: 1,000,000 discriminatie.
- Kosten en tijd:
o PCR goedkoop en kort.
o RFLP veel duurder en langer.
- Nauwkeurigheid (accuracy)
o PCR minder nauwkeurig omdat er contaminatie kan ontstaan door de amplificatie.
o RFLP nauwkeuriger omdat er geen amplificatie nodig is.
Doelen les 1:
1. Waarom wordt DNA als bewijsmateriaal gebruikt?
2. Wat is DNA?
3. Type forensische markers en de eigenschappen.
4. Gebruikte technieken voor het aantonen van forensische markers.
DNA blijft overal achter. Naast het vinden van DNA en het vaststellen van een overeenkomst
tussen het gevonden DNA en de verdachte, is het bij forensisch onderzoek veel belangrijker
om vast te stellen hoe het DNA op de vindplaats terecht gekomen is.
- DNA fingerprint het DNA profiel van een persoon. (de 1% die niet overeen komt met de
rest van de mensen)
- DNA komt zelden in schone vorm voor, met behulp met PCR kan het DNA toch gebruikt
wordt.
- 99.9% van het DNA komt bij ieder mens overeen.
Sensitiviteit vs. Specificiteit
- Sensitiviteit (gevoeligheid) het
percentage zieke mensen die m.b.v. de
diagnostische test ook als ziek worden
geïdentificeerd.
- Specificiteit percentage van gezonde
mensen waarbij de diagnostische test ook
daadwerkelijk aantoont dat zij niet de ziekte
hebben.
Specificiteit is belangrijker in het forensisch onderzoek omdat je dan kan kijken wie
wel of niet de ziekte heeft en zo kan je al mensen afstrepen.
Toepassingen niet-humaan DNA.
- Bacterieel DNA (in grondmonsters) verdachten linken aan een bepaalde locatie of kijken
waar het lijk heeft gelegen.
- Marihuana DNA (DNA van de cannabisplant) distributie netwerken ontrafelen en klonen
van planten onderzoeken.
- Pollen/ planten testen verdachte linken aan een bepaalde locatie.
- Wildlife forensics DNA van bedreigde planten en dieren onderzoeken.
- Soort identificaties bijvoorbeeld kijken of gevonden botten afkomstig zijn van de mens.
- Testen van huisdieren dierenmishandeling, het linken van een verdachte aan een plaats
delict.
DNA
- Deoxy-ribo-nucleic-acid.
- 2 antiparallel, alfa-helix, complementaire strengen met 4 nucleotides.
- Een nucleotide de base + fosfaatgroep + suikergroep.
- Een backbone zijn de fosfaatgroepen.
- Een base is de
Adenine/Thymine/Cytosine/Guanine.
,Waarom is er een 3’ en een 5’ einde?
- Een keten ontstaat altijd van 3’ naar 5’. (aflezen dus altijd van 3’ naar 5’)
Bij DNA synthese wordt er altijd een nieuw atoom aan de 5’ geplakt.
- Deze einden worden 3’ en 5’ genoemd omdat dit de nummers zijn van de C-atomen.
- Bij RNA kan de T base niet meer goed aanhechten, hierdoor is er een U base ontstaan.
Forensische markers
Er zijn meerdere markers nodig voor het opstellen van een DNA profiel.
- Autosomen alle chromosomen behalve de geslachtschromosomen. (nr. 1 t/m 22)
VNTR (niet-coderend DNA)
STR (niet-coderend DNA)
SNP (niet-coderend en
coderend DNA)
- Y chromosomen mannelijk
geslachtschromosoom.
STR (niet-coderend DNA)
Amelogenine (niet-coderend
DNA)
- Mitochondriaal DNA doorgegeven
DNA van de moeder.
SNP (niet-coderend en coderend DNA)
Veel markers liggen in het niet-coderend DNA, omdat hier de meeste verschillen in zitten. Dit
is omdat dit voor niks codeert, waardoor er niks fout kan gaan in het genoom.
SNP kunnen wel in het coderende DNA zitten je hebt een andere base dan het grootste
deel van de wereldbevolking.
3% van het humane genoom bestaat uit niet-coderend DNA.
Bij DNA onderzoek wordt gekeken naar of iemand een STR heeft (heterozygoot of
homozygoot) en hoe lang deze STR’s zijn.
VNTR’s moeten op andere manieren geanalyseerd worden dan STR’s omdat deze veel langer
zijn.
- Locus de locatie van iets op een bepaald chromosoom (kan voor genen maar ook voor
STR’s)
- Allel een type DNA, number of tendem repeats. (je hebt altijd 2 allelen, pathanaal en
methanaal)
STR’s (Short Tandem Repeats)
- Fragment van 2-6 bp.
- 5-200 herhalingen
- Totaal 10-1000 bp.
- Homozygoot en heterozygoot is mogelijk.
- 3% van het humane genoom is niet coderend DNA en heeft dus geen fenotype -- > dit wordt
gezien als de DNA fingerprint.
- Flanking region (= deel DNA dat aan het 5’ eind van het gen zit) is constant PCR wordt
gebruikt voor de analyse in combinatie met capillaire gel elektroforese.
Y-STR’s
- Gebruikt voor pathanaal onderzoek.
- Dit kan dus alleen maar voor mannen (wordt vaak gebruikt bij zedenzaken)
,VNTR’s (Variable Number of Tandem Repeats)
- Variaties in het aantal herhalingen van een bepaalde DNA sequentie.
- De kortere fragmenten worden geanalyseerd met PCR en gelelektroforese of RFLP analyse.
- Herhaling unit van 8-100 bp.
- 10-1500 herhalingen.
- Totaal 500-20.000 bp.
SNP’s (Single Nucleotide Polymorphisms)
- 1 verschil in de nucleotide. (1 nucleotide is anders)
- > 1% van de populatie heeft dit.
- < 1% wordt het een mutatie genoemd.
- Een SNP is dus eigenlijk een veelvoorkomende mutatie.
- SNP profiling wordt vaak gebruikt voor etniciteit onderzoek.
- SNP’s kunnen ook in je mitochondriaal DNA zitten omdat er simpelweg zo veel
mitochondriaal DNA aanwezig is in elke cel.
Welke technieken worden gebruikt voor welke soort marker?
PCR + capillaire gel elektroforese
- Gel elektroforese met kleurtjes en met een laser worden de nucleotiden in fragmenten
gelezen van de STR’s.
- Scheiden en detecteren van PCR producten van STR’s.
- Analyse van STR’s op basis van grootte en kleur.
- Gebruikt bij kleine hoeveelheden DNA (moet geamplificeerd worden)
- Is minder accuraat, omdat bij het amplificeren de primers je monsters minder goed kunnen
maken.
RFLP (restriction fragment length polymorfisme)
- Stappen voor RFLP:
1. Monster cel.
2. DNA extractie.
3. DNA splitsen m.b.v. restrictie enzym.
4. DNA fragmenten scheiden met elektroforese.
5. Verplaatsen naar een membraan (southern blott)
6. Het binden van radioactieve DNA probe aan specifieke DNA fragmenten.
7. Het membraan van het overige probe afwassen.
, 8. Met behulp van een x-ray wordt het radioactieve patroon bekeken.
9. DNA patroon wordt vergeleken.
- Hierbij wordt er gekeken naar grote afwijkingen in bvb de lengtes van de fragmenten.
- DNA worden geknipt door restrictie enzymen op de plekken van een VNTR.
- Er wordt veel DNA gevonden (50 tot 500 ng gevonden)
- Gedegradeerd DNA kan niet gebruikt worden omdat je geen onderscheid kan maken tussen
geknipte stukjes of kapotte stukjes.
- Dit kost meer geld en duurt langer maar is wel accurater.
Voor- en nadelen van PCR en RFLP
- Hoeveelheid DNA:
o PCR ongeveer 20 kopieën (amplificatie)
o RFLP 50-500 ng nodig.
- Gedegradeerd DNA:
o PCR kleine fragmenten nodig, dus prima.
o RFLP hiervoor heb je hoog moleculaire gewicht van DNA nodig. Gedegradeerd
materiaal kan niet gebruikt worden.
- Bekende Loci:
o PCR (STR) 8-9 STR loci genoeg voor 1: 1,000,000,000 discriminatie.
o RFLP (VNTR) 4-6 VNTR loci genoeg voor 1: 1,000,000 discriminatie.
- Kosten en tijd:
o PCR goedkoop en kort.
o RFLP veel duurder en langer.
- Nauwkeurigheid (accuracy)
o PCR minder nauwkeurig omdat er contaminatie kan ontstaan door de amplificatie.
o RFLP nauwkeuriger omdat er geen amplificatie nodig is.
