Cell biology 2
Artikel 1: Betulin induces cytochrome c release and apoptosis in colon cancer cells
via NOXA
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5920149/pdf/ol-15-05-7319.pdf
Abstract
Specifieke tumorcellen zijn gevoelig voor betuline, terwijl gezonde cellen dat niet zijn. Betuline
stimuleert geprogrammeerde celdood (apoptose) in verschillende kankercellijnen; echter het precieze
moleculaire werkingsmechanisme van betuline blijft onbekend. De huidige studie gebruikte
darmkankercellen, waarbij massale apoptose veroorzaakt door betuline werd geïdentificeerd, en het
apoptotische proces bleek plaats te vinden via de activering van caspase-3- en -9-routes. Daarnaast
werd het vrijkomen van cytochroom c gedetecteerd. Bovendien is het pro-apoptotic lid van de
Bcl-2-eiwitfamilie, NOXA, geïnduceerd na behandeling met betulinol, en de neerwaartse regulering
van NOXA onderdrukte duidelijk de afgifte van cytochroom c en apoptose in darmkankercellen.
Omgekeerd, de overexpressie van NOXA versterkte de door betuline geïnduceerde apoptose verder.
Introductie
Betuline → stofje dat gemakkelijk te verkrijgen is vanuit verschillende planten en stimuleert
de apoptose bij variërende kanker cellijnen
- Betulinezuur (afgeleid van betuline) wordt gebruikt als cytotoxisch medicijn om
specifieke tumoren te behandelen vanwege antitumorale eigenschappen
- Specifieke mechanisme is niet bekend
- Gezonde lichaamscellen zijn niet gevoelig voor betulinezuur
Het begin en de progressie van kanker ontstaat door de remming van cellulaire apoptose
- Huidige kankerbehandelingen (chemo- en immunotherapie) functioneren daarom
voornamelijk door het bevorderen van apoptose van tumorcellen
- Deze apoptose kan op twee manieren worden geïnduceerd:
1. Via extracellulaire signalen en dead-receptors (extrinsic pathway)
a. Caspase 8 en 10 zijn hierbij betrokken
2. Via de mitochondriale signaleringsroute (intrinsic pathway)
a. Hierbij is de BCL-2 homologie 3 familie (BH3) betrokken zoals Bcl-2,
NOXA en Bim
b. NOXA en Bim kunnen zorgen voor het induceren van het BAX eiwit
(pro-apoptotisch eiwit) en gaan daarbij het effect van het
anti-apoptotische eiwit BCL-2 tegen
c. Caspase 9 is hierbij betrokken
Doel
Het doel van het onderzoek was het onderzoeken van de antitumorale eigenschappen van
betuline tegen menselijke darmkankercellen en het onderliggende werkingsmechanisme toe
te lichten (op moleculair niveau)
Resultaten
- Betuline concentratie van > 10 µg / ml zorgt voor een significante verminderde
levensvatbaarheid (Y-as) en mindere colonie vorming (D) van HCT116 en HT29
cellen (beide darmkankercellijnen)
1
, - Deze concentratie heeft geen significant effect op normale menselijk
darmcellen (CCD 841 CoN)
- Betuline (10 µg / ml) induceert significant de fragmentatie van kernen bij HCT116 en
HT29 cellen
- Fragmentatie van kernen van CCD 841 CoN cellen was niet significant
verschillend
- Betuline induceert de afgifte van caspase 3, 9 en cytochrome C
- Significant verhoogde caspase 9 was zichtbaar na 4 uur behandeling,
significant verhoogde caspase 3 was zichtbaar na 8 uur behandeling en het
niveau van caspase 8 activiteit veranderde niet significant
- Cytochrome C werd vrijgegeven in het cytosol na behandeling en was minder
aanwezig in de mitochondria
- NOXA bemiddelt apoptose na betuline behandeling bij darmkankercellen
- mRNA niveau van NOXA (significant) en Bim was verhoogd na behandeling
terwijl PUMA en BAD levels onveranderd bleven
- Aantal gefragmenteerde kernen en cytochrome C afgifte was verhoogd door
NOXA en werd significant opgeheven door het toevoegen van siRNA tegen
NOXA (waardoor NOXA dus werd afgebroken)
Conclusie en discussie
- Betuline is in staat om apoptose in (menselijke) darmkankercellen te activeren via de
caspase 3 en 9 activering route
- Betuline is daarnaast betrokken bij het vrijgeven van cytochrome C
- Betuline behandeling zorgt voor induceren van pro-apoptotische eiwit NOXA
- Knock-down van NOXA zorgt ervoor dat apoptose weer geremd wordt
- Caspases worden via twee routes geactiveerd
1. Via intracellulaire signalen en dead-receptors (extrinsic pathway)
a. Caspase 3, 8 en 10 zijn hierbij betrokken
2. Via de mitochondriale signaleringsroute (intrinsic pathway)
a. Hierbij wordt cytochrome C vrijgegeven waardoor apoptotic protease
apoptotic protease-activating factor 1 (Apaf-1) wordt geactiveerd
b. Apaf-1 zorgt voor de activatie van caspase 9
- De BCL-2 familie is sterk betrokken bij apoptose
- Bid en Bim hebben directe interactie met BAX (pro-apoptotisch eiwit)
- NOXA, BAD en puma hebben indirecte interactie
2
, - Inductie van NOXA is noodzakelijk voor betuline geïnduceerde apoptose en afgifte
van cytochrome C bij darmkankercellen
- Aangezien er een kleine stijging was van cytochrome C bij een knockdown
van NOXA, zijn hierbij ook andere mechanismen betrokken
- Betuline heeft anti-tumor capaciteiten door apoptose te induceren in
darmkankercellen
- Cytochrome C afgifte en de daaropvolgende activatie van caspases zegt dat
apoptose via de intrinsic pathway wordt geïnduceerd (mitochondriale
route)
Pathways
1. Caspase activatie → er zijn twee type caspases
a. Initiator caspases → zorgen voor de splitsing en activatie van de executioner
caspases
b. Executioner caspases → zorgen voor initiatie van apoptose
→ hoe werken deze caspases?
- Alle caspases zijn als een inactieve precursor aanwezig = procaspases
- Splitsing van deze procaspases maakt ze actief = caspases
- De initiator procaspases zijn inactieve monomeren en door een
apoptotisch signaal binden adaptor eiwitten aan de 2 monomeren
- Hierdoor gaan de twee initiator caspases elkaar splitsen → ze
maken elkaar dus actief (procaspase → caspase)
- De adaptor eiwitten verschillen in de intrinsic en extrinsic
pathway (aangezien er verschillende initiator procaspases
geactiveerd moeten worden)
- FADD adaptor eiwit →
activatie van procaspase 8 en
10 (extrinsic pathway)
- APAF-1 adaptor eiwit →
activatie van procaspase 9
(intrinsic pathway)
- De actieve initiator caspases zorgen voor
splitsing en activatie van executioner
procaspases (procaspase → caspase)
- Actieve executioner caspases zorgen voor de
initiatie van apoptose
2. Intrinsic apoptose pathway (via mitochondriën)
→ wordt getriggerd door intercellulaire stimulus zoals gebrek aan
overlevingsfactoren, DNA schade of ER stress
a. MOMP zorgt voor het vrijgeven van cytochrome C vanuit de mitochondriën
b. Met cytochrome C wordt een apoptosome gevormd
i. Bestaat uit APAF-1 eiwitten en cytochrome C
c. Apoptosoom (voornamelijk APAF-1) zorgt voor de activatie van initiator
procaspase 9 (procaspase → caspase)
d. Initiator caspase 9 zorgt voor de activatie van executioner procaspase 3, 6 en
7 → zorgen voor apoptose van de cel
3
, → deze pathway wordt gereguleerd door de BCL-2 familie
- BCL-2, BCL-XL zijn anti-apoptotische eiwitten
- Bax en Bak zijn pro-apoptotische eiwitten
- Bax en Bak stimuleren het vrijkomen van MOMP
- Bax en Bak worden gestimuleerd door de BH3-only eiwitten (BID,
BIM, BAD, NOXA en PUMA)
3. Extrinsic apoptose pathway
→ wordt gestimuleerd door binding van extracellulaire signalen aan death receptors
a. Binding van een ligand aan een death receptor zorgt voor vorming van het
DISC complex
b. DISC complex (voornamelijk het FADD adaptor eiwit) zorgt voor de activatie
van initiator procaspase 8 en 10 (procaspase → caspase)
c. Initiator caspase 8 en 10 zorgen voor de activatie van executioner
procaspase 3, 6 en 7 → zorgen voor apoptose van de cel
→ betulin heeft een significant effect op de de expressie van procaspase 9 en heeft dus
vooral invloed op de intrinsic apoptose pathway
4
Artikel 1: Betulin induces cytochrome c release and apoptosis in colon cancer cells
via NOXA
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5920149/pdf/ol-15-05-7319.pdf
Abstract
Specifieke tumorcellen zijn gevoelig voor betuline, terwijl gezonde cellen dat niet zijn. Betuline
stimuleert geprogrammeerde celdood (apoptose) in verschillende kankercellijnen; echter het precieze
moleculaire werkingsmechanisme van betuline blijft onbekend. De huidige studie gebruikte
darmkankercellen, waarbij massale apoptose veroorzaakt door betuline werd geïdentificeerd, en het
apoptotische proces bleek plaats te vinden via de activering van caspase-3- en -9-routes. Daarnaast
werd het vrijkomen van cytochroom c gedetecteerd. Bovendien is het pro-apoptotic lid van de
Bcl-2-eiwitfamilie, NOXA, geïnduceerd na behandeling met betulinol, en de neerwaartse regulering
van NOXA onderdrukte duidelijk de afgifte van cytochroom c en apoptose in darmkankercellen.
Omgekeerd, de overexpressie van NOXA versterkte de door betuline geïnduceerde apoptose verder.
Introductie
Betuline → stofje dat gemakkelijk te verkrijgen is vanuit verschillende planten en stimuleert
de apoptose bij variërende kanker cellijnen
- Betulinezuur (afgeleid van betuline) wordt gebruikt als cytotoxisch medicijn om
specifieke tumoren te behandelen vanwege antitumorale eigenschappen
- Specifieke mechanisme is niet bekend
- Gezonde lichaamscellen zijn niet gevoelig voor betulinezuur
Het begin en de progressie van kanker ontstaat door de remming van cellulaire apoptose
- Huidige kankerbehandelingen (chemo- en immunotherapie) functioneren daarom
voornamelijk door het bevorderen van apoptose van tumorcellen
- Deze apoptose kan op twee manieren worden geïnduceerd:
1. Via extracellulaire signalen en dead-receptors (extrinsic pathway)
a. Caspase 8 en 10 zijn hierbij betrokken
2. Via de mitochondriale signaleringsroute (intrinsic pathway)
a. Hierbij is de BCL-2 homologie 3 familie (BH3) betrokken zoals Bcl-2,
NOXA en Bim
b. NOXA en Bim kunnen zorgen voor het induceren van het BAX eiwit
(pro-apoptotisch eiwit) en gaan daarbij het effect van het
anti-apoptotische eiwit BCL-2 tegen
c. Caspase 9 is hierbij betrokken
Doel
Het doel van het onderzoek was het onderzoeken van de antitumorale eigenschappen van
betuline tegen menselijke darmkankercellen en het onderliggende werkingsmechanisme toe
te lichten (op moleculair niveau)
Resultaten
- Betuline concentratie van > 10 µg / ml zorgt voor een significante verminderde
levensvatbaarheid (Y-as) en mindere colonie vorming (D) van HCT116 en HT29
cellen (beide darmkankercellijnen)
1
, - Deze concentratie heeft geen significant effect op normale menselijk
darmcellen (CCD 841 CoN)
- Betuline (10 µg / ml) induceert significant de fragmentatie van kernen bij HCT116 en
HT29 cellen
- Fragmentatie van kernen van CCD 841 CoN cellen was niet significant
verschillend
- Betuline induceert de afgifte van caspase 3, 9 en cytochrome C
- Significant verhoogde caspase 9 was zichtbaar na 4 uur behandeling,
significant verhoogde caspase 3 was zichtbaar na 8 uur behandeling en het
niveau van caspase 8 activiteit veranderde niet significant
- Cytochrome C werd vrijgegeven in het cytosol na behandeling en was minder
aanwezig in de mitochondria
- NOXA bemiddelt apoptose na betuline behandeling bij darmkankercellen
- mRNA niveau van NOXA (significant) en Bim was verhoogd na behandeling
terwijl PUMA en BAD levels onveranderd bleven
- Aantal gefragmenteerde kernen en cytochrome C afgifte was verhoogd door
NOXA en werd significant opgeheven door het toevoegen van siRNA tegen
NOXA (waardoor NOXA dus werd afgebroken)
Conclusie en discussie
- Betuline is in staat om apoptose in (menselijke) darmkankercellen te activeren via de
caspase 3 en 9 activering route
- Betuline is daarnaast betrokken bij het vrijgeven van cytochrome C
- Betuline behandeling zorgt voor induceren van pro-apoptotische eiwit NOXA
- Knock-down van NOXA zorgt ervoor dat apoptose weer geremd wordt
- Caspases worden via twee routes geactiveerd
1. Via intracellulaire signalen en dead-receptors (extrinsic pathway)
a. Caspase 3, 8 en 10 zijn hierbij betrokken
2. Via de mitochondriale signaleringsroute (intrinsic pathway)
a. Hierbij wordt cytochrome C vrijgegeven waardoor apoptotic protease
apoptotic protease-activating factor 1 (Apaf-1) wordt geactiveerd
b. Apaf-1 zorgt voor de activatie van caspase 9
- De BCL-2 familie is sterk betrokken bij apoptose
- Bid en Bim hebben directe interactie met BAX (pro-apoptotisch eiwit)
- NOXA, BAD en puma hebben indirecte interactie
2
, - Inductie van NOXA is noodzakelijk voor betuline geïnduceerde apoptose en afgifte
van cytochrome C bij darmkankercellen
- Aangezien er een kleine stijging was van cytochrome C bij een knockdown
van NOXA, zijn hierbij ook andere mechanismen betrokken
- Betuline heeft anti-tumor capaciteiten door apoptose te induceren in
darmkankercellen
- Cytochrome C afgifte en de daaropvolgende activatie van caspases zegt dat
apoptose via de intrinsic pathway wordt geïnduceerd (mitochondriale
route)
Pathways
1. Caspase activatie → er zijn twee type caspases
a. Initiator caspases → zorgen voor de splitsing en activatie van de executioner
caspases
b. Executioner caspases → zorgen voor initiatie van apoptose
→ hoe werken deze caspases?
- Alle caspases zijn als een inactieve precursor aanwezig = procaspases
- Splitsing van deze procaspases maakt ze actief = caspases
- De initiator procaspases zijn inactieve monomeren en door een
apoptotisch signaal binden adaptor eiwitten aan de 2 monomeren
- Hierdoor gaan de twee initiator caspases elkaar splitsen → ze
maken elkaar dus actief (procaspase → caspase)
- De adaptor eiwitten verschillen in de intrinsic en extrinsic
pathway (aangezien er verschillende initiator procaspases
geactiveerd moeten worden)
- FADD adaptor eiwit →
activatie van procaspase 8 en
10 (extrinsic pathway)
- APAF-1 adaptor eiwit →
activatie van procaspase 9
(intrinsic pathway)
- De actieve initiator caspases zorgen voor
splitsing en activatie van executioner
procaspases (procaspase → caspase)
- Actieve executioner caspases zorgen voor de
initiatie van apoptose
2. Intrinsic apoptose pathway (via mitochondriën)
→ wordt getriggerd door intercellulaire stimulus zoals gebrek aan
overlevingsfactoren, DNA schade of ER stress
a. MOMP zorgt voor het vrijgeven van cytochrome C vanuit de mitochondriën
b. Met cytochrome C wordt een apoptosome gevormd
i. Bestaat uit APAF-1 eiwitten en cytochrome C
c. Apoptosoom (voornamelijk APAF-1) zorgt voor de activatie van initiator
procaspase 9 (procaspase → caspase)
d. Initiator caspase 9 zorgt voor de activatie van executioner procaspase 3, 6 en
7 → zorgen voor apoptose van de cel
3
, → deze pathway wordt gereguleerd door de BCL-2 familie
- BCL-2, BCL-XL zijn anti-apoptotische eiwitten
- Bax en Bak zijn pro-apoptotische eiwitten
- Bax en Bak stimuleren het vrijkomen van MOMP
- Bax en Bak worden gestimuleerd door de BH3-only eiwitten (BID,
BIM, BAD, NOXA en PUMA)
3. Extrinsic apoptose pathway
→ wordt gestimuleerd door binding van extracellulaire signalen aan death receptors
a. Binding van een ligand aan een death receptor zorgt voor vorming van het
DISC complex
b. DISC complex (voornamelijk het FADD adaptor eiwit) zorgt voor de activatie
van initiator procaspase 8 en 10 (procaspase → caspase)
c. Initiator caspase 8 en 10 zorgen voor de activatie van executioner
procaspase 3, 6 en 7 → zorgen voor apoptose van de cel
→ betulin heeft een significant effect op de de expressie van procaspase 9 en heeft dus
vooral invloed op de intrinsic apoptose pathway
4
