Genomics -> het genoom
Structurele annotatie: genoom wordt geanalyseerd om te kijken wat er allemaal in het genoom
zit en waar coderende regio’s zich bevinden (ORF)
Functionele annotatie: wat doen genen en andere DNA-elementen
Sanger sequencing:
-PCR
-Lange reads
-Traag
Illumina sequencing (Hiseq):
-Geen PCR
-Korte reads (nauwkeurig)
-Snel
Pacific biosciences:
-Geen PCR
-Lange reads
-Medium speed
Nanopore sequencing (MINion):
-Geen PCR
-Extreem lange reads
-Medium speed
Whole genome sequencing (WGS)
We isoleren DNA uit een sample. Ons DNA wordt in stukken geknipt, we houden fragmenten over
van honderden baseparen lang. Vervolgens wordt er doormiddel van sequencing methodes reads
gemaakt. Dit zijn stukjes van de fragmenten waar de DNA-sequentie van bekend is. We hebben
single-end reads en paired-end reads. Doormiddel van die reads kunnen we overlappende
sequenties gaan samenvoegen en zo maken we contings, dit proces noemen we assemblage.
Contings zijn dus langere bekende DNA-sequenties door het samenvoegen van reads na
assemblage. Vervolgens gaan we de contings samenvoegen tot scaffold. Vaak komt het voor dat
een bepaalde sequentie mist en die geven we dan weer als NNN.
Dan wordt het belangrijk om te achterhalen waar coderende genen zitten. Hiervoor gaan we opzoek
naar een open reading frame (ORF). Dit is een aaneengesloten DNA sequentie zonder
stopcodons. Let wel op dat eukaryoten introns hebben, terwijl prokaryoten dit niet hebben.
Voorkeurscodons: ieder organisme heeft zijn eigen voorkeurscodons, dit is gebaseerd op hoeveel
tRNA er beschikbaar is. Genen met een hoge eiwitexpressie gebruiken vaak voorkeurscodons, dit
geeft dus ook een indicatie van een potentieel eiwit coderende regio.
CAI: in hoeverre een ORF de voorkeurscodons gebruikt
Shine Dalgardo sequentie (prokaryoten): de opstartplaats van het ribosoom bij prokaryoten
heeft een specifieke sequentie, vinden we deze sequentie in het genoom dan hebben we dus een
goede indicatie van een potentieel eiwit coderende regio.
InterProscan: tool waarmee je jouw eiwit coderende sequentie kan opzoeken in een databank en
zo de functie van het eiwit kan benoemen. Het benoemen van een functie van een eiwit wordt
gedaan door gene ontologie termen.
Gene ontology: moleculaire functie, biologisch proces, cellulair component
Go-evidence: code die aangeeft hoe de functie van het eiwit is afgeleid en daarop gebaseerd hoe
betrouwbaar het is
Resequencing: je vergelijkt je reads met een referentiegenoom en probeert zo SNP’s, deleties en
inserties op te sporen.
VAF: reads die een variatie tonen/ totale aantal reads *100%
Pile-up: weergave van alle reads die op 1 plek (bijv. bp 124) gedaan zijn
Bruijn Graph: maakt moeilijke assemblage, bijvoorbeeld met veel repeterende sequenties,
, makkelijker.
Genome coverage: totale gesequensed base/ totale lengte genoom = <30
Readlenght: hoeveel bp lang een read is
Read depht: het aantal keer dat een base gelezen is door een sequencing methode. Hoe vaker
hoe zekerder je kan zeggen dat een variatie echt een SNP is en geen meetfout.
Repeat masking: je maskeert repeterende sequenties van een eukaryoot genoom om zo
assemblage makkelijker te maken
BLAST: vergelijkt je eiwitsequentie met andere soorten
HMM: kijkt of je eiwit bij een eiwitfamilie hoort
Seminar - Genomics:
De conservation-track: laat zien hoe sterk een DNA-regio evolutionair geconserveerd is tussen
verschillende soorten. Bij sterke conservatie is de sequentie belangrijk, en blijft hetzelfde door
evolutie. Bij slechte conservatie is de sequentie minder belangrijk, en verandert die makkelijker.
Read density track: pieken laten zien dat er veel reads zijn van dit gen, weinig pieken betekend
minder hoge expressie. Geen pieken betekend geen bewijs voor transcriptie
Operon: in prokaryoten meerdere genen die door 1 regulerende regio wordt gereguleerd. Ze
hebben dezelfde transcriptie richting en liggen dicht op elkaar.
GC-skew: negatieve GC-waarde, wat betekent dat er meer C’s dan G’s op de forward-streng
aanwezig zijn. Positieve GC waarde, wat betekent dat er daar meer G’s dan C’s op de forward-
streng zijn. Deze overgang in GC skew kan wijzen op een functionele grens in het genoom.
Exonen zijn sterk geconserveerd en intronen niet. Er komen maar weinig SNP’s voor in exonen
omdat dit vaak kan leiden tot grote negatieve gevolgen. Geconserveerde regio’s tussen genen
wijzen vaak op regulerende regio’s.
Transcriptomics -> mRNA
Kwantitatieve analyse: welke mRNA’s zijn waar aanwezig
Kwalitatieve analyse: hoeveel mRNA is er aanwezig
Ribosoomprofilering: de cel een shock geven tijdens translatie waardoor de ribosoom een stuk
mRNA beschermd. Alleen deze RNA’s gebruik je zodat je zeker weet dat je alleen mRNA hebt.
Poly-A-selectie: eukaryoten hebben een poly-A-staart aan hun mRNA, door tijdens cDNA synthese
alleen oligo-dt-primers te gebruiken weet je zeker dat je alleen mRNA hebt
Crosslinking: je mRNA moleculen eerst laten linken aan eiwitten, dit kunnen alleen mRNA
moleculen dus dan weet je ook zeker dat je alleen mRNA hebt.
Microarray: je hebt een glasplaatje met probes die complementair zijn aan bekende cDNA
moleculen. cDNA wordt fluoriserend gemaakt per monster en vervolgens over de glasplaat
gegoten. De complementaire cDNA moleculen zullen binden aan de probes waardoor je aan de
fluorescentie kan zien in welk monster wel mRNA aanwezig is. Er is wel een vorm van bias want A/T
bindt beter dan G/C en op de glasplaat zelf bindt ook de ene kant beter dan de andere kant. Ook
moet de concentratie target veel hoger zijn dan de concentratie probe. Ook zit er een limiet op
hoeveel cDNA kan binden aan 1 probe. Verder kan je de intensiteit van de kleur vergelijken en zo
expressie relatief vergelijken.
RNA-seq: je zal eerst mRNA uit de cel moeten isoleren, vervolgens behandel je dit met Dnase
omdat er soms DNA meekomt en dat willen we niet. Dan maken we van mRNA cDNA, dit is veel
stabieler. Dan doen we DNA-sequencing waardoor we reads hebben. Tijdens mapping gaan we
onze reads mappen op een referentie genoom. Sommige reads geven een exon-exon overgang
weer. Op ons referentie genoom zit daar een intron tussen maar omdat intronen er bij splicing uit
gehaald worden heeft ons mRNA dit niet. Hierdoor kan een read dus het eind van exon 1 bevatten
en begin van exon 2.
Read count: hoeveel reads je van 1 gen hebt, dit geeft de genexpressie weer
Structurele annotatie: genoom wordt geanalyseerd om te kijken wat er allemaal in het genoom
zit en waar coderende regio’s zich bevinden (ORF)
Functionele annotatie: wat doen genen en andere DNA-elementen
Sanger sequencing:
-PCR
-Lange reads
-Traag
Illumina sequencing (Hiseq):
-Geen PCR
-Korte reads (nauwkeurig)
-Snel
Pacific biosciences:
-Geen PCR
-Lange reads
-Medium speed
Nanopore sequencing (MINion):
-Geen PCR
-Extreem lange reads
-Medium speed
Whole genome sequencing (WGS)
We isoleren DNA uit een sample. Ons DNA wordt in stukken geknipt, we houden fragmenten over
van honderden baseparen lang. Vervolgens wordt er doormiddel van sequencing methodes reads
gemaakt. Dit zijn stukjes van de fragmenten waar de DNA-sequentie van bekend is. We hebben
single-end reads en paired-end reads. Doormiddel van die reads kunnen we overlappende
sequenties gaan samenvoegen en zo maken we contings, dit proces noemen we assemblage.
Contings zijn dus langere bekende DNA-sequenties door het samenvoegen van reads na
assemblage. Vervolgens gaan we de contings samenvoegen tot scaffold. Vaak komt het voor dat
een bepaalde sequentie mist en die geven we dan weer als NNN.
Dan wordt het belangrijk om te achterhalen waar coderende genen zitten. Hiervoor gaan we opzoek
naar een open reading frame (ORF). Dit is een aaneengesloten DNA sequentie zonder
stopcodons. Let wel op dat eukaryoten introns hebben, terwijl prokaryoten dit niet hebben.
Voorkeurscodons: ieder organisme heeft zijn eigen voorkeurscodons, dit is gebaseerd op hoeveel
tRNA er beschikbaar is. Genen met een hoge eiwitexpressie gebruiken vaak voorkeurscodons, dit
geeft dus ook een indicatie van een potentieel eiwit coderende regio.
CAI: in hoeverre een ORF de voorkeurscodons gebruikt
Shine Dalgardo sequentie (prokaryoten): de opstartplaats van het ribosoom bij prokaryoten
heeft een specifieke sequentie, vinden we deze sequentie in het genoom dan hebben we dus een
goede indicatie van een potentieel eiwit coderende regio.
InterProscan: tool waarmee je jouw eiwit coderende sequentie kan opzoeken in een databank en
zo de functie van het eiwit kan benoemen. Het benoemen van een functie van een eiwit wordt
gedaan door gene ontologie termen.
Gene ontology: moleculaire functie, biologisch proces, cellulair component
Go-evidence: code die aangeeft hoe de functie van het eiwit is afgeleid en daarop gebaseerd hoe
betrouwbaar het is
Resequencing: je vergelijkt je reads met een referentiegenoom en probeert zo SNP’s, deleties en
inserties op te sporen.
VAF: reads die een variatie tonen/ totale aantal reads *100%
Pile-up: weergave van alle reads die op 1 plek (bijv. bp 124) gedaan zijn
Bruijn Graph: maakt moeilijke assemblage, bijvoorbeeld met veel repeterende sequenties,
, makkelijker.
Genome coverage: totale gesequensed base/ totale lengte genoom = <30
Readlenght: hoeveel bp lang een read is
Read depht: het aantal keer dat een base gelezen is door een sequencing methode. Hoe vaker
hoe zekerder je kan zeggen dat een variatie echt een SNP is en geen meetfout.
Repeat masking: je maskeert repeterende sequenties van een eukaryoot genoom om zo
assemblage makkelijker te maken
BLAST: vergelijkt je eiwitsequentie met andere soorten
HMM: kijkt of je eiwit bij een eiwitfamilie hoort
Seminar - Genomics:
De conservation-track: laat zien hoe sterk een DNA-regio evolutionair geconserveerd is tussen
verschillende soorten. Bij sterke conservatie is de sequentie belangrijk, en blijft hetzelfde door
evolutie. Bij slechte conservatie is de sequentie minder belangrijk, en verandert die makkelijker.
Read density track: pieken laten zien dat er veel reads zijn van dit gen, weinig pieken betekend
minder hoge expressie. Geen pieken betekend geen bewijs voor transcriptie
Operon: in prokaryoten meerdere genen die door 1 regulerende regio wordt gereguleerd. Ze
hebben dezelfde transcriptie richting en liggen dicht op elkaar.
GC-skew: negatieve GC-waarde, wat betekent dat er meer C’s dan G’s op de forward-streng
aanwezig zijn. Positieve GC waarde, wat betekent dat er daar meer G’s dan C’s op de forward-
streng zijn. Deze overgang in GC skew kan wijzen op een functionele grens in het genoom.
Exonen zijn sterk geconserveerd en intronen niet. Er komen maar weinig SNP’s voor in exonen
omdat dit vaak kan leiden tot grote negatieve gevolgen. Geconserveerde regio’s tussen genen
wijzen vaak op regulerende regio’s.
Transcriptomics -> mRNA
Kwantitatieve analyse: welke mRNA’s zijn waar aanwezig
Kwalitatieve analyse: hoeveel mRNA is er aanwezig
Ribosoomprofilering: de cel een shock geven tijdens translatie waardoor de ribosoom een stuk
mRNA beschermd. Alleen deze RNA’s gebruik je zodat je zeker weet dat je alleen mRNA hebt.
Poly-A-selectie: eukaryoten hebben een poly-A-staart aan hun mRNA, door tijdens cDNA synthese
alleen oligo-dt-primers te gebruiken weet je zeker dat je alleen mRNA hebt
Crosslinking: je mRNA moleculen eerst laten linken aan eiwitten, dit kunnen alleen mRNA
moleculen dus dan weet je ook zeker dat je alleen mRNA hebt.
Microarray: je hebt een glasplaatje met probes die complementair zijn aan bekende cDNA
moleculen. cDNA wordt fluoriserend gemaakt per monster en vervolgens over de glasplaat
gegoten. De complementaire cDNA moleculen zullen binden aan de probes waardoor je aan de
fluorescentie kan zien in welk monster wel mRNA aanwezig is. Er is wel een vorm van bias want A/T
bindt beter dan G/C en op de glasplaat zelf bindt ook de ene kant beter dan de andere kant. Ook
moet de concentratie target veel hoger zijn dan de concentratie probe. Ook zit er een limiet op
hoeveel cDNA kan binden aan 1 probe. Verder kan je de intensiteit van de kleur vergelijken en zo
expressie relatief vergelijken.
RNA-seq: je zal eerst mRNA uit de cel moeten isoleren, vervolgens behandel je dit met Dnase
omdat er soms DNA meekomt en dat willen we niet. Dan maken we van mRNA cDNA, dit is veel
stabieler. Dan doen we DNA-sequencing waardoor we reads hebben. Tijdens mapping gaan we
onze reads mappen op een referentie genoom. Sommige reads geven een exon-exon overgang
weer. Op ons referentie genoom zit daar een intron tussen maar omdat intronen er bij splicing uit
gehaald worden heeft ons mRNA dit niet. Hierdoor kan een read dus het eind van exon 1 bevatten
en begin van exon 2.
Read count: hoeveel reads je van 1 gen hebt, dit geeft de genexpressie weer
