WC 5/6 PRESENTATIE
ONDERWERP
Alternatieve transcriptiestartplaatsen in het menselijke genoom.
Er wordt ons aangeleerd dat transcriptie start bij specifieke startplaatsen op het genoom.
Dit bracht ons op de gedachte of dat er ook transcriptie kan plaatsvinden waarbij er niet
gebruik wordt gemaakt van de klassieke promotorsequenties die de startplaatsen
aangeven.
INTRODUCTIE ONDERWERP
Transcriptie is een belangrijk proces in cellen waarbij DNA wordt omgezet in RNA.
Normaal gesproken begint dit proces bij een specifieke DNA-sequentie, ook wel een
promotor. Een voorbeeld hiervan is de TATA-box. Echter gaat dit onderzoek erover of dat
het menselijk genoom ook transcriptiestartplaatsen kan hebben die functioneren zonder
het gebruik van klassieke promotorsequenties.
ONDERZOEKSVRAAG
Bestaan er in het menselijk genoom alternatieve transcriptie startplaatsen die
onafhankelijk functioneren van klassieke promotorsequenties?
HYPOTHESE
Het menselijk genoom bevat alternatieve transcriptiestartplaatsen (aTSS) die in
afwezigheid van klassieke promotorsequenties zelfstandig transcriptie kunnen initiëren.
Deze alternatieve startplaatsen worden mogelijk gereguleerd door lokale epigenetische
kenmerken, zoals open chromatinestructuur of enhancer-activiteit.
Grootschalige CAGE-analyses (zoals de FANTOM5-studie) (1) tonen aan dat het menselijk
genoom duizenden TSS-signalen bevat die zich niet in de buurt van bekende promotors
bevinden. Veel van deze signalen liggen in enhancerregio’s en kunnen leiden tot de
vorming van zogenaamde enhancer RNA’s (eRNA’s). Dit suggereert dat transcriptie-
initiaties ook buiten klassieke promotorstructuren kunnen optreden. Uit onderzoek van
Andersson (2) blijkt dat slechts een klein deel van de humane promotors een klassieke
TATA-box bevat. In veel gevallen wordt transcriptie-initiatie mogelijk gemaakt door
alternatieve sequentiemotieven, wat erop duidt dat er meerdere, niet-canonieke
mechanismen voor transcriptie-initiatie bestaan. Studies tonen aan dat enhancers niet
alleen genexpressie op afstand reguleren, maar ook zelf transcriptie kunnen starten van
korte RNA’s, zogeheten enhancer RNA’s (eRNAs) (3). Dit suggereert dat de aanwezigheid
van open chromatine en specifieke histonmodificaties voldoende kan zijn om transcriptie-
initiatie mogelijk te maken.
METHODE
Stap 1: CAGE
Dit detecteert de 5’-cap van mRNA, hiermee kan dus bepaalt worden waar transcriptie
begint. Deze data kan je vergelijken met bekende promotorlocaties, om startplaatsen
buiten klassieke promotorregio’s te vinden.
- Isolatie RNA
- Cap-trapping (enkel gecapte mRNA’s)
, - Omzetten mRNA (messenger RNA) in cDNA (complementary DNA) (tag aan 5’
eind)
- Sequencing op cDNA fragmenten
- Lokaliseer de reads (korte stukjes DNA/RNA) op het genoom (elke read komt
overeen met een specifieke locatie op het DNA, dus kun je zien waar transcriptie is
begonnen)
- Identificeer pieken die overeenkomen met startsites (pieken zijn regio’s waar veel
reads aanwezig zijn die starten op dezelfde plek en duidt op een TSS)
- Vergelijk deze pieken met bekende locaties van klassieke promotoren (gebruik
hierbij een database als FANTOM soort promotoratlas, met duizenden bekende
TSS en promotorlocaties)
- Valideer een kleine selectie kandidaten met 5’ -RACE om zeker te zijn van
startsites en niet recapping (recapping eruit filteren en zo het exacte uiteinde te
vinden, door het colledige 5 einde van het transcript te reconstrueren)
Isolatie van mRNA
Alleen gecapte mRNA’s worden geselecteerd.
Reverse transcriptie
Het mRNA wordt omgezet in cDNA met een primer die aan het poly-A-staartje
bindt.
Toevoegen van een adapter aan het 5’-uiteinde
Een adapter wordt geligeerd aan het begin van het cDNA, zodat je weet waar het
startpunt zit.
PCR-amplificatie
Met primers die binden aan de adapter en aan het gen van interesse, wordt het 5’-
einde versterkt.
Sequencing van het PCR-product
Je bepaalt de exacte sequentie van het 5’-uiteinde en vergelijkt die met je CAGE-
data.
- Selecteer de startsites die buiten de bekende promotorregio’s liggen als
kandidaten voor de alternatieve startsites
Stap 2:
Met behulp van CRISPR-Cas9 klassieke promotoren uit het genoom halen (knockout).
- Ontwerp meerde guide RNAs per promotor die de bekende startsites dekken. (o.a.
TATA-BOX etc.) (zodat klassieke promotorregio’s worden uitgeschakeld via single
guide RNA) (meerdere guides doordat promotors zijn verspreidt over meerdere
basenparen, dus dan hogere effectiviteit onderdrukking)
- Transfecteer cellen met CRISPRi plasmider (CRISPi is minder ingrijpend dan
CRISPR-Cas9, gebruikt wel deactief Cas9 die niet knipt maar wel transcriptie
blokkeert, door binding DNA
- Gebruik qPCR (quantitatieve PRC) om te kijken of de genexpressie is
verminderd/verdwenen na verwijdering klassieke promotor.
Stap 3:
Gebruik RNA-sequencing om te kijken of de eerder gevonden mogelijk alternatieve
startsites nog actief zijn na knockout van klassieke promotoren.
Volgende stappen bij zowel knockout- als controlecellen:
- Isoleer totaal RNA
- Voer sequencing uit (Illumina platform) (zet RNA om in cDNA, reverse transcriptie,
sequence DNA voor nauwkeurigheid)
ONDERWERP
Alternatieve transcriptiestartplaatsen in het menselijke genoom.
Er wordt ons aangeleerd dat transcriptie start bij specifieke startplaatsen op het genoom.
Dit bracht ons op de gedachte of dat er ook transcriptie kan plaatsvinden waarbij er niet
gebruik wordt gemaakt van de klassieke promotorsequenties die de startplaatsen
aangeven.
INTRODUCTIE ONDERWERP
Transcriptie is een belangrijk proces in cellen waarbij DNA wordt omgezet in RNA.
Normaal gesproken begint dit proces bij een specifieke DNA-sequentie, ook wel een
promotor. Een voorbeeld hiervan is de TATA-box. Echter gaat dit onderzoek erover of dat
het menselijk genoom ook transcriptiestartplaatsen kan hebben die functioneren zonder
het gebruik van klassieke promotorsequenties.
ONDERZOEKSVRAAG
Bestaan er in het menselijk genoom alternatieve transcriptie startplaatsen die
onafhankelijk functioneren van klassieke promotorsequenties?
HYPOTHESE
Het menselijk genoom bevat alternatieve transcriptiestartplaatsen (aTSS) die in
afwezigheid van klassieke promotorsequenties zelfstandig transcriptie kunnen initiëren.
Deze alternatieve startplaatsen worden mogelijk gereguleerd door lokale epigenetische
kenmerken, zoals open chromatinestructuur of enhancer-activiteit.
Grootschalige CAGE-analyses (zoals de FANTOM5-studie) (1) tonen aan dat het menselijk
genoom duizenden TSS-signalen bevat die zich niet in de buurt van bekende promotors
bevinden. Veel van deze signalen liggen in enhancerregio’s en kunnen leiden tot de
vorming van zogenaamde enhancer RNA’s (eRNA’s). Dit suggereert dat transcriptie-
initiaties ook buiten klassieke promotorstructuren kunnen optreden. Uit onderzoek van
Andersson (2) blijkt dat slechts een klein deel van de humane promotors een klassieke
TATA-box bevat. In veel gevallen wordt transcriptie-initiatie mogelijk gemaakt door
alternatieve sequentiemotieven, wat erop duidt dat er meerdere, niet-canonieke
mechanismen voor transcriptie-initiatie bestaan. Studies tonen aan dat enhancers niet
alleen genexpressie op afstand reguleren, maar ook zelf transcriptie kunnen starten van
korte RNA’s, zogeheten enhancer RNA’s (eRNAs) (3). Dit suggereert dat de aanwezigheid
van open chromatine en specifieke histonmodificaties voldoende kan zijn om transcriptie-
initiatie mogelijk te maken.
METHODE
Stap 1: CAGE
Dit detecteert de 5’-cap van mRNA, hiermee kan dus bepaalt worden waar transcriptie
begint. Deze data kan je vergelijken met bekende promotorlocaties, om startplaatsen
buiten klassieke promotorregio’s te vinden.
- Isolatie RNA
- Cap-trapping (enkel gecapte mRNA’s)
, - Omzetten mRNA (messenger RNA) in cDNA (complementary DNA) (tag aan 5’
eind)
- Sequencing op cDNA fragmenten
- Lokaliseer de reads (korte stukjes DNA/RNA) op het genoom (elke read komt
overeen met een specifieke locatie op het DNA, dus kun je zien waar transcriptie is
begonnen)
- Identificeer pieken die overeenkomen met startsites (pieken zijn regio’s waar veel
reads aanwezig zijn die starten op dezelfde plek en duidt op een TSS)
- Vergelijk deze pieken met bekende locaties van klassieke promotoren (gebruik
hierbij een database als FANTOM soort promotoratlas, met duizenden bekende
TSS en promotorlocaties)
- Valideer een kleine selectie kandidaten met 5’ -RACE om zeker te zijn van
startsites en niet recapping (recapping eruit filteren en zo het exacte uiteinde te
vinden, door het colledige 5 einde van het transcript te reconstrueren)
Isolatie van mRNA
Alleen gecapte mRNA’s worden geselecteerd.
Reverse transcriptie
Het mRNA wordt omgezet in cDNA met een primer die aan het poly-A-staartje
bindt.
Toevoegen van een adapter aan het 5’-uiteinde
Een adapter wordt geligeerd aan het begin van het cDNA, zodat je weet waar het
startpunt zit.
PCR-amplificatie
Met primers die binden aan de adapter en aan het gen van interesse, wordt het 5’-
einde versterkt.
Sequencing van het PCR-product
Je bepaalt de exacte sequentie van het 5’-uiteinde en vergelijkt die met je CAGE-
data.
- Selecteer de startsites die buiten de bekende promotorregio’s liggen als
kandidaten voor de alternatieve startsites
Stap 2:
Met behulp van CRISPR-Cas9 klassieke promotoren uit het genoom halen (knockout).
- Ontwerp meerde guide RNAs per promotor die de bekende startsites dekken. (o.a.
TATA-BOX etc.) (zodat klassieke promotorregio’s worden uitgeschakeld via single
guide RNA) (meerdere guides doordat promotors zijn verspreidt over meerdere
basenparen, dus dan hogere effectiviteit onderdrukking)
- Transfecteer cellen met CRISPRi plasmider (CRISPi is minder ingrijpend dan
CRISPR-Cas9, gebruikt wel deactief Cas9 die niet knipt maar wel transcriptie
blokkeert, door binding DNA
- Gebruik qPCR (quantitatieve PRC) om te kijken of de genexpressie is
verminderd/verdwenen na verwijdering klassieke promotor.
Stap 3:
Gebruik RNA-sequencing om te kijken of de eerder gevonden mogelijk alternatieve
startsites nog actief zijn na knockout van klassieke promotoren.
Volgende stappen bij zowel knockout- als controlecellen:
- Isoleer totaal RNA
- Voer sequencing uit (Illumina platform) (zet RNA om in cDNA, reverse transcriptie,
sequence DNA voor nauwkeurigheid)
