Moleculaire Biologie Technieken
Les 1: Kloneren
Moleculair kloneren
Kloneren = het produceren (vermeningvuldigen) van genetisch identieke dieren, planten, cellen,
bacteriën.
Moleculair kloneren = het genereren van recombinant DNA en de replicatie daarvan in gast
organismen, gebruikendmakend van moleculair biologische technieken.
- Vermeningvuldigen (amplificieren) van een stuk DNA/gene of interest
- Analyseren van een stuk DNA/gene of interest
- Manipuleren van een stuk DNA/gene of interest
- Productie van recombinante eiwitten (medicatie)
- Manipuleren van een organisme door het inbrengen van recombinant DNA
DNA amplificatie door bacteriën
Plasmide DNA als kloneervector:
- Klein circulair bacterieel DNA (niet chromosomaal)
- Dragen niet-essentiele genen, maar geven bacterie onder bepaalde omstandigheden een
groei voordeel
- Bekendste voorbeeld: Antibiotica resistentie
- Eenvoudig te manipuleren
- Gebruikt om nieuwe genen te generen, vermenigvuldigen en tot expressie te brengen
Afkomstig van aangepaste natuurlijke plasmiden. Commerciëel verkrijgbaar. De kloneerplasmiden
bevatten een ORI = bindingsplaats voor DNA polymerase = startplaats van replicatie. Ze bevatten ook
een cluster van een unieke knipsite = MCS en selectiemarkers.
E.coli als replicatie machine. De vector repliceert in de gastheercel dankzij eigen origin. De
gastheercellen delen en delen. De verdeling vectoren over dochtercellen = vele generaties. Het netto
resultaat = een enorme vermenigvuldiging van de vector inclusie insert. Het groeit zowel in vloeibaar
als in vast medium. Op een vast medium zal een cel zich niet verplaatsen, maar wel delen.
Natuurlijke processen nagebootst in het lab om nieuwe combinaties van DNA te creëeren:
Recombinant DNA technologie.
, Enzymen Type enzymen
Specifieke actie Nucleases, restrictie enzymen – knippen
Voorspelbare actie Modificatoren – bewerken
Controleerbaar Ligases-plakken
Makkelijk verkrijgbaar Polymerases-kopieren
Nucleases-Knippen en plakken
- Exo en endo nucleases
- DNA en RNA nucleases
- Ss en ds nucleases
- Specifiek en aspecifiek
Restricitie endonucleases = restrictie enzyme Endo, DNA, ds, specifiek. Het knippen en plakken is
een natuurlijke rol voor de restrictie enzym. Nucleases knippen tussen deoxyribose en fosfaatgroep
(verbreken fosfo-diester verbinding). Fosfaat blijft achter op de 5’-kant van de fragmenten.
Nucleases:
- Bacteriestammen hebben unieke restrictie enzymen
- Meer dan 3000 verschillende bekend
- Ruim 600 zijn commercieel verkrijgbaar
- Naamgeving verwijst naar oorspronkelijke stam
- Unieke combinatie van
Herkenningssequentie
Manier van knippen
De meeste restrictie-enzymen werken als homodimeer (twee identieke units). Daarom vertonen
herkenningssites bijna altijd omgekeerde symmetrie, van 5’ naar 3’ dezelfde sequentie op beide
strengen.
Herkenningssequenties zijn tussen de 4 en 8 nucleotiden lang. Hoe langer hoe zeldzamer de site,
specifieker knippen. De meeste enzymen knippen binnen de herkenningssequentie. Er zijn
verschillende enzymen met verschillende herkenningssequenties, maar leveren dezelfde overhang
op compatibel. Kan heel handig zijn bij knip- en plakwerk.
Isoschizomeren. Verschillende enzymen met dezelfde herkenningssequentie. Bovendien dezelfde
manier van knippen. Kan handig zijn als één van beiden geschikter is voor de gekozen
reactiecoditites.
Neo-isoschizomeren. Verschillende enzymen met dezelfde herkenningssequentie. Echter
verschillende manier van knippen.
Herkennings sequenties Manier van knippen
Normale situatie Verschillend Verschillend
Isoschizomeer Gelijk Gelijk
Neo-isoschizomeer Gelijk Verschillend
Gebruik restrictie enzymen. Generen van specifieke overhangen. Fragmenten met dezelfde overhang
kunnen met elkaar verbonden worden. Kan heel handig zijn bij knip- en plakwerk. Het enzym ligase
herstelt de DNA fosfodiester binding.
, Blunt ligatie
Ligatie is minder efficiënt op blunt uiteinden (dubbelstrengs ligatie). Uiteinden moeten toevallig bij
elkaar in de buurt komen (ligase kan ze niet zelf bij elkaar zoeken).
Sticky ligatie
Uiteinden sticky annealing, blijft even vast zitten ligase heeft meer tijd om te binden, hoger
succes %.
Transformatie van E.coli vermenigvuldiging en DNA isolatie. Transformatie technieken:
- Heat shock
- Electroporatie
Vermeningvuldiging, isolatie
- Fenol extratie
- Miniprep
DNA isolatie
Het inbouwen van insert in een vector door middel van recombinant DNA technologie. Een
gastheercel wordt getransformeerd met een vector. Gastheerce gaat delen en de vector repliceren
(inslucief insert). Isolatie van plasmiden (miniprep). Wat wil je kwijt raken bij plasmide isolatie:
- Celwand van gram0negatieve bacteria
- Genomische DNA
- Eiwitten
Lysozymen hebben een lyserende werking op sommige bacteriën. Het enzym wordt gevormd
door neutrofielen, granulocyten (en de voorgangers van dit stadium), monocyten en macrofagen.
1. Verzwakken bacteriele celwand met lysozym en EDTA
2. Lyseren van cellen met SDS en NaOH
3. Neutraliseren van lysaat met kaliumacetaat
4. Precipitaite cel debris Plasmide precipiteren niet
5. Fenol extractive
6. Ethanol precipitatie
Optioneel toevoegen:
- EDTA inactiveert nucleases
- Proteases
- RNAse
Kits en automatisering
- Plasmiden of genomische DNA
- DNA of RNA
- Veel of weinig samples
- Research of routine
Totaal RNA isolatie. RNA wordt in principe op dezelfde manier geïsoleerd als DNA, maar het RNA is
zeer instabiel, het RNAse zeer stabiel. Een daarom
- Onmiddellijk na isolatie snap freeze van samples in vloeibare stikstof
Les 1: Kloneren
Moleculair kloneren
Kloneren = het produceren (vermeningvuldigen) van genetisch identieke dieren, planten, cellen,
bacteriën.
Moleculair kloneren = het genereren van recombinant DNA en de replicatie daarvan in gast
organismen, gebruikendmakend van moleculair biologische technieken.
- Vermeningvuldigen (amplificieren) van een stuk DNA/gene of interest
- Analyseren van een stuk DNA/gene of interest
- Manipuleren van een stuk DNA/gene of interest
- Productie van recombinante eiwitten (medicatie)
- Manipuleren van een organisme door het inbrengen van recombinant DNA
DNA amplificatie door bacteriën
Plasmide DNA als kloneervector:
- Klein circulair bacterieel DNA (niet chromosomaal)
- Dragen niet-essentiele genen, maar geven bacterie onder bepaalde omstandigheden een
groei voordeel
- Bekendste voorbeeld: Antibiotica resistentie
- Eenvoudig te manipuleren
- Gebruikt om nieuwe genen te generen, vermenigvuldigen en tot expressie te brengen
Afkomstig van aangepaste natuurlijke plasmiden. Commerciëel verkrijgbaar. De kloneerplasmiden
bevatten een ORI = bindingsplaats voor DNA polymerase = startplaats van replicatie. Ze bevatten ook
een cluster van een unieke knipsite = MCS en selectiemarkers.
E.coli als replicatie machine. De vector repliceert in de gastheercel dankzij eigen origin. De
gastheercellen delen en delen. De verdeling vectoren over dochtercellen = vele generaties. Het netto
resultaat = een enorme vermenigvuldiging van de vector inclusie insert. Het groeit zowel in vloeibaar
als in vast medium. Op een vast medium zal een cel zich niet verplaatsen, maar wel delen.
Natuurlijke processen nagebootst in het lab om nieuwe combinaties van DNA te creëeren:
Recombinant DNA technologie.
, Enzymen Type enzymen
Specifieke actie Nucleases, restrictie enzymen – knippen
Voorspelbare actie Modificatoren – bewerken
Controleerbaar Ligases-plakken
Makkelijk verkrijgbaar Polymerases-kopieren
Nucleases-Knippen en plakken
- Exo en endo nucleases
- DNA en RNA nucleases
- Ss en ds nucleases
- Specifiek en aspecifiek
Restricitie endonucleases = restrictie enzyme Endo, DNA, ds, specifiek. Het knippen en plakken is
een natuurlijke rol voor de restrictie enzym. Nucleases knippen tussen deoxyribose en fosfaatgroep
(verbreken fosfo-diester verbinding). Fosfaat blijft achter op de 5’-kant van de fragmenten.
Nucleases:
- Bacteriestammen hebben unieke restrictie enzymen
- Meer dan 3000 verschillende bekend
- Ruim 600 zijn commercieel verkrijgbaar
- Naamgeving verwijst naar oorspronkelijke stam
- Unieke combinatie van
Herkenningssequentie
Manier van knippen
De meeste restrictie-enzymen werken als homodimeer (twee identieke units). Daarom vertonen
herkenningssites bijna altijd omgekeerde symmetrie, van 5’ naar 3’ dezelfde sequentie op beide
strengen.
Herkenningssequenties zijn tussen de 4 en 8 nucleotiden lang. Hoe langer hoe zeldzamer de site,
specifieker knippen. De meeste enzymen knippen binnen de herkenningssequentie. Er zijn
verschillende enzymen met verschillende herkenningssequenties, maar leveren dezelfde overhang
op compatibel. Kan heel handig zijn bij knip- en plakwerk.
Isoschizomeren. Verschillende enzymen met dezelfde herkenningssequentie. Bovendien dezelfde
manier van knippen. Kan handig zijn als één van beiden geschikter is voor de gekozen
reactiecoditites.
Neo-isoschizomeren. Verschillende enzymen met dezelfde herkenningssequentie. Echter
verschillende manier van knippen.
Herkennings sequenties Manier van knippen
Normale situatie Verschillend Verschillend
Isoschizomeer Gelijk Gelijk
Neo-isoschizomeer Gelijk Verschillend
Gebruik restrictie enzymen. Generen van specifieke overhangen. Fragmenten met dezelfde overhang
kunnen met elkaar verbonden worden. Kan heel handig zijn bij knip- en plakwerk. Het enzym ligase
herstelt de DNA fosfodiester binding.
, Blunt ligatie
Ligatie is minder efficiënt op blunt uiteinden (dubbelstrengs ligatie). Uiteinden moeten toevallig bij
elkaar in de buurt komen (ligase kan ze niet zelf bij elkaar zoeken).
Sticky ligatie
Uiteinden sticky annealing, blijft even vast zitten ligase heeft meer tijd om te binden, hoger
succes %.
Transformatie van E.coli vermenigvuldiging en DNA isolatie. Transformatie technieken:
- Heat shock
- Electroporatie
Vermeningvuldiging, isolatie
- Fenol extratie
- Miniprep
DNA isolatie
Het inbouwen van insert in een vector door middel van recombinant DNA technologie. Een
gastheercel wordt getransformeerd met een vector. Gastheerce gaat delen en de vector repliceren
(inslucief insert). Isolatie van plasmiden (miniprep). Wat wil je kwijt raken bij plasmide isolatie:
- Celwand van gram0negatieve bacteria
- Genomische DNA
- Eiwitten
Lysozymen hebben een lyserende werking op sommige bacteriën. Het enzym wordt gevormd
door neutrofielen, granulocyten (en de voorgangers van dit stadium), monocyten en macrofagen.
1. Verzwakken bacteriele celwand met lysozym en EDTA
2. Lyseren van cellen met SDS en NaOH
3. Neutraliseren van lysaat met kaliumacetaat
4. Precipitaite cel debris Plasmide precipiteren niet
5. Fenol extractive
6. Ethanol precipitatie
Optioneel toevoegen:
- EDTA inactiveert nucleases
- Proteases
- RNAse
Kits en automatisering
- Plasmiden of genomische DNA
- DNA of RNA
- Veel of weinig samples
- Research of routine
Totaal RNA isolatie. RNA wordt in principe op dezelfde manier geïsoleerd als DNA, maar het RNA is
zeer instabiel, het RNAse zeer stabiel. Een daarom
- Onmiddellijk na isolatie snap freeze van samples in vloeibare stikstof
