Moleculaire Biologie
Les 1
Inleiding
De grootte van het genoom zegt niet perse iets over het aantal genen. Het verschil tussen de
prokaryote cel en de eukaryote cel:
Prokaryoot Eukaryoot
Geen celkern Celkern
Circulair genomisch DNA Lineair genomisch DNA
Geen organellen Organellen
Kleiner Groter
Celwand Soms een celwand (planten)
Genoom = 1 hele set van genetisch materiaal in een cel (DNA en RNA)
Gen = Stuk van het DNA, dat codeert voor een eiwit of functioneel RNA
Genexpressie stappen
Gen (DNA) TRANSCRIPTIE Pre-mRNA SPLICING funtioneel mRNA TRANSLATIE
Polypeptide POST-TRANSLATIONALE MODIFICATIES funtioneel eiwit
Splicing = alle intronen weghalen. Het DNA bestaat uit exonen en intronen. Na splicing blijven de
exonen over, soms missen er ook exonen waardoor er meerdere eiwitten kunnen ontstaan.
Structuur van DNA
dsDNA = dubbelstrengs
- SPECIFIEKE BASEPARING
- COMPLEMENTAIR
- ANTIPARALLEL
- RECHTSDRAAIENDE DUBBELE HELIX
De afstand tussen de twee strengen is altijd constant. Beide strengen zijn complementair en bevatten
beide alle informatie. Dit maakt replicatie (DNA synthese) en transcriptie (RNA synthese) mogelijk. De
oude strengen zijn de moeder strengen, die gaan elk uit elkaar en vormen een template streng voor
de nieuwe streng.
De nucleotides bestaan uit een pentose suiker groep
met daaraan koolstofatomen. Bij de tweede plek,
rechts van 3’ kan een OH of een H groep zitten.
,OH = ribose
H = deoxyribose
De N-base kan vijf verschillende basen vormen. De pyrimidinen (1 ring):
- C, CYTOSINE
- T, THYMINE (DNA)
- U, URACIL (RNA)
Of de purinen (2 ringen)
- A, ADENINE
- G, GUANINE
Het verschil tussen DNA en RNA:
DNA RNA
Deoxyribose Ribose
Basen: Basen:
A = deoxyadenosine A = adenosine
G = deoxyguanosine G = guanosine
C = deoxycytdine C = cytidine
T = Thymidine U = uridine
Dubbelstrengs enkelstrengs
Omdat A en T (U) en G en C met elkaar binden ontstaan er waterstofbruggen. Tussen A en T
ontstaan er twee H-bruggen en tussen G en C ontstaan er drie H-bruggen. Dit betekent ook dat de
binding tussen G en C sterker is dan de binding tussen A en T.
De niet covalente krachten binnen het DNA zijn de waterstofbruggen, Van der Waalskracht (tussen
gestapelde basen), hydrofobe interacties (minor groove) en de electrostatisch (tussen DNA en
eiwitten).
Eigenschappen DNA polymerase
- De MEESTE DNA polymerasen hebben een matrijs/template nodig
- ALLE DNA polymerase hebben een beginstukje nodig, dit kan bestaan uit RNA of DNA (=primer)
- ALLE DNA polymerase synthetiseren DNA van 5’ naar 3’ richting
- SOMMIGE DNA polymerasen hebben exonuclease activiteit
3’ 5’ = proofreading
5’ 3’ = weghalen primer
Bij het kopieren van de genetische informatie ontstaan er twee complementaire strengen DNA. De
een is nieuwe aangemaakt tegen één van de twee oude aan. Er blijft dus één oude streng over, dus is
dit semi conservatief
,DNA replicatie door DNA polymerase
- Matrijs afhankelijk
- Semiconservatief
- Trifosfaat nucleotide als substraat
- Koppelt trifosfaat nucleotide aan 3’-OH einde
- Alleen koppeling wanneer 3’-OH einde beschikbaar is
- Alleen koppeling wanneer baseparing plaatsvindt
- Eén fosfaatgroep wordt ingebouwd, pyrofosfaat + energie komen vrij
- Tot 1000 nucleotiden per sec in prokaryoten
- Tot 50 nucleotiden per sec in eukaryoten
DNA en RNA synthese is uitsluitend van 5’ naar 3’. De nieuwe nucleotiden worden dus aan de 3’ eind
vastgemaakt.
Exonuclease activiteiten van DNA polymerase. Bij verkeerd geplaatste nucleotiden wordt de primer
weggehaald. DIT GEBEURT ALTIJD VAN 5’ 3’.
Bij verkeerde nucleotiden worden de nucleotiden verwijderd, dit is proofreading en dit gebeurt altijd
van 3’ 5’.
Niet alle DNA polymerases hebben (beide) exonuclease activiteiten.
Herstel replicatiefouten
Dor chemische veranderingen kunnen basen soms verkeerd koppelen. Een T kan perongeluk aan een
G binden en een A aan een C. Dit noemen we tautomeren. De mismatch wordt hersteld door
exonuclease acticiteit van DNA polymerase of door een repair mechanisme.
PROOFREADING = herstel replicatiefouten.
Baseparing van laatst aangebrachte nucleotide zijn noodzakelijk voor DNA polymerase. Als er een
mismatch is stopt de DNA polymerase. Een ander deel, een aparte subunit of domein, verwijdert de
nucleotide weer. Dit is exonuclease activiteit van 3’ 5’ voor proofreading. De nucleotide worden
opnieuw aangebracht. Dit gebeurt zowel in prokaryoten als in eukaryoten.
STAND-DIRECTED MISMATCH REPAIR
Stel de fout blijft zitten, dan kan vlak na de replicatie de mismatch tussen de basen herstel worden
door het Mut complex. MutS herkent mismatch (geen baseparing, maar iets anders in de helixvorm).
In prokaryoten en eukaryoten bevat de vers gerepliceerde DNA of nicks (nog geen ligase langs
geweest. De MutL herkent dit.
Bij prokaryoten heeft de vers gerepliceerde DNA nog geen gemethyleerde GA*TC. De niet
gemethyleerde DNA streng wordt geknipt door MutH. Er vind dan een afbraak van een deel van de
nieuwe streng plaats. Opnieuw komt er DNA polymerase activiteit, zowel in prokaryoten als in
eukaryoten.
Dus MutS herkent mismatch en MutL identificeert nieuwe streng door nabijgelegen “nick”. Nicks zijn
vaker aanwezig in de nieuw gevormde streng, op die manier maakt dit complex onderscheid tussen
de oude streng en de nieuw gevormde streng. MutL triggert de degradatie van de nicked-strand.
WIJ EUKARYOTEN HEBBEN GEEN POLYMERASE MET 5’ 3’ EXONUCLEASE, DUS PROOFREADING. ZE ZIJN NIET IN STAAT
OM RNA PRIMERS TE VERWIJDEREN.
Waarom DNA synthese van 5’ naar 3’?
Elongatie van 5’ naar 3’ kan doorgaan als een fout verwijderd is door de exonuclease proofreading
activiteit. Als de groep van 3’ naar 5’ zou zijn, dan wordt door proofreading verdere elongatie
geblokkeerd omdat er geen trifosfaat (energie) meer beschikbaar is.
, Les 2
De drie fasen van DNA replicatie:
1. Initatie (start)
2. Elongatie (synthese)
3. Terminatie (stop)
Initiatiefase van DNA replicatie
Relicatie is meestal bidirectioneel? Replicatie begint bij specifieke DNA sequentie het ORI: ORIGIN OF
REPLICATION. Bepaalde initiator proteins herkennen het ORI en binden hieraan:
1. Het opbreken van de dubbele helix met helicase
2. Het aanleggen van de RNA primers met primase
3. De DNA synthese gaat beginnen in de replication bubble.
Prokaryoten
Prokaryoten chromosomen bevatten maar 1 ORI. Er is alleen activatie
indien er voldoende voedingsstoffen aanwezig zijn voor een volledige
celdeling. Na de replicatie treedt er celdeling op. In de prokaryote ORI zijn
er twee verschillende nucleotide repeats:
1. 9-nucleotide repeats. Hiervan zijn er 5. Hieraan bindt het
initatiatie complex voor replicatie (dnaA initiator eiwitten)
2. 13-nucleotide repeats. Hiervan zijn er 3. Dit zijn A=T rijke motieven
makkelijk open te breken door de torsiale stress die ontstaat na
de binding van het dnaA complex.
Eiwitbinding prokaryote
ORI
- DnaA, initiator eiwit
bindt aan specifieke sequentie torsiale stress DNA breekt open op AT rijke sequentie
- DnaB, helicase
bindt aan DnaA m.b.v. DnaC
- DnaC, helicase loading protein
blokkeert het helicase, totdat het correct geplaatst is op de ORI
- DnaG, primase
plaatst primer op enkelstrengs DNA
A herkent specifieke sequentie, breekt dubbelstrengs open.
B bind aan enkelstrengs dankzij C, breekt de rest open wanneer C wegvalt.
G brengt primer aan (altijd RNA DNA polymerase altijd dubbelstrengs synthese).
Bij prokaryoten is de ORI slechts één keer actief per celdeling. EEN VOLLEDIG GEMETHYLEERDE ORI = ACTIEF
= REPLICATIE. EEN HEMIGEMETHYLEERDE ORI = INACTIEF GEEN REPLICATIE. Zolang DNA hemimethylated is, is
er geen inhibitor eiwit gebonden aan de ORI. Pas na volledige methylering van de A’s in GATC
sequenties door een DNA methylase (Dam methylase), kan de ORI opnieuw worden gebruikt.
Les 1
Inleiding
De grootte van het genoom zegt niet perse iets over het aantal genen. Het verschil tussen de
prokaryote cel en de eukaryote cel:
Prokaryoot Eukaryoot
Geen celkern Celkern
Circulair genomisch DNA Lineair genomisch DNA
Geen organellen Organellen
Kleiner Groter
Celwand Soms een celwand (planten)
Genoom = 1 hele set van genetisch materiaal in een cel (DNA en RNA)
Gen = Stuk van het DNA, dat codeert voor een eiwit of functioneel RNA
Genexpressie stappen
Gen (DNA) TRANSCRIPTIE Pre-mRNA SPLICING funtioneel mRNA TRANSLATIE
Polypeptide POST-TRANSLATIONALE MODIFICATIES funtioneel eiwit
Splicing = alle intronen weghalen. Het DNA bestaat uit exonen en intronen. Na splicing blijven de
exonen over, soms missen er ook exonen waardoor er meerdere eiwitten kunnen ontstaan.
Structuur van DNA
dsDNA = dubbelstrengs
- SPECIFIEKE BASEPARING
- COMPLEMENTAIR
- ANTIPARALLEL
- RECHTSDRAAIENDE DUBBELE HELIX
De afstand tussen de twee strengen is altijd constant. Beide strengen zijn complementair en bevatten
beide alle informatie. Dit maakt replicatie (DNA synthese) en transcriptie (RNA synthese) mogelijk. De
oude strengen zijn de moeder strengen, die gaan elk uit elkaar en vormen een template streng voor
de nieuwe streng.
De nucleotides bestaan uit een pentose suiker groep
met daaraan koolstofatomen. Bij de tweede plek,
rechts van 3’ kan een OH of een H groep zitten.
,OH = ribose
H = deoxyribose
De N-base kan vijf verschillende basen vormen. De pyrimidinen (1 ring):
- C, CYTOSINE
- T, THYMINE (DNA)
- U, URACIL (RNA)
Of de purinen (2 ringen)
- A, ADENINE
- G, GUANINE
Het verschil tussen DNA en RNA:
DNA RNA
Deoxyribose Ribose
Basen: Basen:
A = deoxyadenosine A = adenosine
G = deoxyguanosine G = guanosine
C = deoxycytdine C = cytidine
T = Thymidine U = uridine
Dubbelstrengs enkelstrengs
Omdat A en T (U) en G en C met elkaar binden ontstaan er waterstofbruggen. Tussen A en T
ontstaan er twee H-bruggen en tussen G en C ontstaan er drie H-bruggen. Dit betekent ook dat de
binding tussen G en C sterker is dan de binding tussen A en T.
De niet covalente krachten binnen het DNA zijn de waterstofbruggen, Van der Waalskracht (tussen
gestapelde basen), hydrofobe interacties (minor groove) en de electrostatisch (tussen DNA en
eiwitten).
Eigenschappen DNA polymerase
- De MEESTE DNA polymerasen hebben een matrijs/template nodig
- ALLE DNA polymerase hebben een beginstukje nodig, dit kan bestaan uit RNA of DNA (=primer)
- ALLE DNA polymerase synthetiseren DNA van 5’ naar 3’ richting
- SOMMIGE DNA polymerasen hebben exonuclease activiteit
3’ 5’ = proofreading
5’ 3’ = weghalen primer
Bij het kopieren van de genetische informatie ontstaan er twee complementaire strengen DNA. De
een is nieuwe aangemaakt tegen één van de twee oude aan. Er blijft dus één oude streng over, dus is
dit semi conservatief
,DNA replicatie door DNA polymerase
- Matrijs afhankelijk
- Semiconservatief
- Trifosfaat nucleotide als substraat
- Koppelt trifosfaat nucleotide aan 3’-OH einde
- Alleen koppeling wanneer 3’-OH einde beschikbaar is
- Alleen koppeling wanneer baseparing plaatsvindt
- Eén fosfaatgroep wordt ingebouwd, pyrofosfaat + energie komen vrij
- Tot 1000 nucleotiden per sec in prokaryoten
- Tot 50 nucleotiden per sec in eukaryoten
DNA en RNA synthese is uitsluitend van 5’ naar 3’. De nieuwe nucleotiden worden dus aan de 3’ eind
vastgemaakt.
Exonuclease activiteiten van DNA polymerase. Bij verkeerd geplaatste nucleotiden wordt de primer
weggehaald. DIT GEBEURT ALTIJD VAN 5’ 3’.
Bij verkeerde nucleotiden worden de nucleotiden verwijderd, dit is proofreading en dit gebeurt altijd
van 3’ 5’.
Niet alle DNA polymerases hebben (beide) exonuclease activiteiten.
Herstel replicatiefouten
Dor chemische veranderingen kunnen basen soms verkeerd koppelen. Een T kan perongeluk aan een
G binden en een A aan een C. Dit noemen we tautomeren. De mismatch wordt hersteld door
exonuclease acticiteit van DNA polymerase of door een repair mechanisme.
PROOFREADING = herstel replicatiefouten.
Baseparing van laatst aangebrachte nucleotide zijn noodzakelijk voor DNA polymerase. Als er een
mismatch is stopt de DNA polymerase. Een ander deel, een aparte subunit of domein, verwijdert de
nucleotide weer. Dit is exonuclease activiteit van 3’ 5’ voor proofreading. De nucleotide worden
opnieuw aangebracht. Dit gebeurt zowel in prokaryoten als in eukaryoten.
STAND-DIRECTED MISMATCH REPAIR
Stel de fout blijft zitten, dan kan vlak na de replicatie de mismatch tussen de basen herstel worden
door het Mut complex. MutS herkent mismatch (geen baseparing, maar iets anders in de helixvorm).
In prokaryoten en eukaryoten bevat de vers gerepliceerde DNA of nicks (nog geen ligase langs
geweest. De MutL herkent dit.
Bij prokaryoten heeft de vers gerepliceerde DNA nog geen gemethyleerde GA*TC. De niet
gemethyleerde DNA streng wordt geknipt door MutH. Er vind dan een afbraak van een deel van de
nieuwe streng plaats. Opnieuw komt er DNA polymerase activiteit, zowel in prokaryoten als in
eukaryoten.
Dus MutS herkent mismatch en MutL identificeert nieuwe streng door nabijgelegen “nick”. Nicks zijn
vaker aanwezig in de nieuw gevormde streng, op die manier maakt dit complex onderscheid tussen
de oude streng en de nieuw gevormde streng. MutL triggert de degradatie van de nicked-strand.
WIJ EUKARYOTEN HEBBEN GEEN POLYMERASE MET 5’ 3’ EXONUCLEASE, DUS PROOFREADING. ZE ZIJN NIET IN STAAT
OM RNA PRIMERS TE VERWIJDEREN.
Waarom DNA synthese van 5’ naar 3’?
Elongatie van 5’ naar 3’ kan doorgaan als een fout verwijderd is door de exonuclease proofreading
activiteit. Als de groep van 3’ naar 5’ zou zijn, dan wordt door proofreading verdere elongatie
geblokkeerd omdat er geen trifosfaat (energie) meer beschikbaar is.
, Les 2
De drie fasen van DNA replicatie:
1. Initatie (start)
2. Elongatie (synthese)
3. Terminatie (stop)
Initiatiefase van DNA replicatie
Relicatie is meestal bidirectioneel? Replicatie begint bij specifieke DNA sequentie het ORI: ORIGIN OF
REPLICATION. Bepaalde initiator proteins herkennen het ORI en binden hieraan:
1. Het opbreken van de dubbele helix met helicase
2. Het aanleggen van de RNA primers met primase
3. De DNA synthese gaat beginnen in de replication bubble.
Prokaryoten
Prokaryoten chromosomen bevatten maar 1 ORI. Er is alleen activatie
indien er voldoende voedingsstoffen aanwezig zijn voor een volledige
celdeling. Na de replicatie treedt er celdeling op. In de prokaryote ORI zijn
er twee verschillende nucleotide repeats:
1. 9-nucleotide repeats. Hiervan zijn er 5. Hieraan bindt het
initatiatie complex voor replicatie (dnaA initiator eiwitten)
2. 13-nucleotide repeats. Hiervan zijn er 3. Dit zijn A=T rijke motieven
makkelijk open te breken door de torsiale stress die ontstaat na
de binding van het dnaA complex.
Eiwitbinding prokaryote
ORI
- DnaA, initiator eiwit
bindt aan specifieke sequentie torsiale stress DNA breekt open op AT rijke sequentie
- DnaB, helicase
bindt aan DnaA m.b.v. DnaC
- DnaC, helicase loading protein
blokkeert het helicase, totdat het correct geplaatst is op de ORI
- DnaG, primase
plaatst primer op enkelstrengs DNA
A herkent specifieke sequentie, breekt dubbelstrengs open.
B bind aan enkelstrengs dankzij C, breekt de rest open wanneer C wegvalt.
G brengt primer aan (altijd RNA DNA polymerase altijd dubbelstrengs synthese).
Bij prokaryoten is de ORI slechts één keer actief per celdeling. EEN VOLLEDIG GEMETHYLEERDE ORI = ACTIEF
= REPLICATIE. EEN HEMIGEMETHYLEERDE ORI = INACTIEF GEEN REPLICATIE. Zolang DNA hemimethylated is, is
er geen inhibitor eiwit gebonden aan de ORI. Pas na volledige methylering van de A’s in GATC
sequenties door een DNA methylase (Dam methylase), kan de ORI opnieuw worden gebruikt.
