''Samenvatting'' Moleculaire Biologie

Samenvatting Moleculaire Biologie
Les 1:
Genoom
tRNA komt van DNA(gen)
Gen codeert voor alle functionele RNA
tRNA functie: aminozuur meeslepen
Eukaryoot groter dan prokaryoot, celwand
Suiker + P + base=nucleotide
C=G
A=T
5’ naar 3’ richting

Pyrimidine: C, T, U
Purine: A, G

Telling suiker: eerste 1is waar base aan zit
DNA =deoxyribose: OH minder dan RNA
Trinucleotide=3P
P aan 5e C
Suikergroep is pentose

DNA polymerase:
 Begin nodig -> primer
 Okazaki fragmenten op lagging strand
 Kan terug(herstellen) d.m.v. exonuclease activiteit 5’ naar 3’

Mut complex controleert fouten na de replicatie

Les 2:
Prokaryoot:
Replicatie start bij ori
Bidirectioneel
Voor binden eerst AT rijk gebied(niet zulke sterke binding namelijk)
Initiatie eiwitten nodig
DNA-A koppelt aan het AT rijk gebied-> DNA schiet open door torsiaal kracht
DNA-A gaat weg, ori niet meer nodig
Helicase breekt dubbele helix verder open
Primase zet primer op DNA
Ori een keer actief per celdeling
Zolang het DNA gemethyleerd is kan het van start gaan in de celkern
(prokaryoten)
Hemimethylering voorkomt dat ori opnieuw gebruikt wordt

Eukaryoot:
Celcyclus
Celdeling klaar-> fosfaatgroep weg
Ori 1 keer per celdeling gerepliceerd worden want initiatie eiwit op ori kan alleen
voor replicatie zorgen als het niet gefosforileerd is
Ligase plakt dicht

Prokaryoot: DNA polymerase I haalt primer weg mbv exonuclease activiteit 5’
naar 3’, kan zelf plakken
Eukaryoot: haalt primer weg met RNase en dan DNA polymerase vult gat

,Sliding clamb houdt DNA polymerase aan DNA

Eukaryoten: DNA om histoneiwitten -> deel gaat aan ene kant parental streng en
aan andere gerepliceerd -> dan wordt het weer angevuld

Leading loopt altijd tegen lagging

In prokaryoot: terminatie eiwitten binden aan terminatie sequentie, DNA
polymerase kan aan een kant er door heen

Telomeer




Zonder telomeren chromosoom 1 t/m 23 aan elkaar geplakt

Telomerase(bevat RNA streng maakt DNA daaraan) bindt aan telomeercel->
gebeurt alleen in stamcellen, embryonale cellen, geslachtscellen en tumorcellen.

DNA polymerase I heeft RNase activiteit(bevat)


Les 1 & 2:
DNA expressie= van gen naar mRNA naar eiwit
Genoom: 1 hele set van genetisch materiaal in een cel. Dit kan bestaan uit DNA
of RNA.
Gen: Stuk van het DNA, dat codeert voor een eiwit of functioneel RNA.
Gen expressie: gen (DNA) transcriptie pre-mRNA splicing (editing)
(functioneel) mRNA translatie
polypeptide post-translationale modificaties functioneel eiwit

Drie domeinen in leven: dia 17
Bacteriën: prokaryoot
Archea: prokaryoot
Eukaryoten: dieren, planten, schimmels, protozoa

DNA:
 Rechtsdraaiende helix
 Specifieke baseparing A-T, C-G (RNA U-A)
 Strengen complementair
 A-T: twee H-bruggen, C-G: drie H-bruggen(sterker!)
 Anti parallel

Purine: 2 blokjes A,G
Pyrimidine: 1 blokje T, C, U


Niet covalente krachten binnen DNA:
- Waterstofbruggen (tussen beide strengen)
- Hydrofobe interactie (minor groove)

,- Electrostatisch (interactie tussen pos en neg geladen ionen; tussen DNA en
eiwitten)

Pentose: 1,2,3,4,5(‘losse C’)

Polymerisatie van nucleotiden:
 Nucleotide bindt aan 3’ einde van DNA streng, een fosfaat groep blijft
zitten en twee vallen af

5’ end is fosfaat groep
3’ end is suiker

Nucleotide=fosfaat + suiker + base
Nucleoside=suiker+base
Aan C2
RNA = ribose (OH)
DNA = deoxyribose (H)

Nucleosid
Base e
adenin
e adenosine
guanin
e guanosine
cytosin
e cytidine
uracil uridine
thymin
e thymidine

ATP=adenosine trifosfaat(tri, di, mono)

Replicatie:
1.Replicatie is semi-conservatief en template (matrijs) afhankelijk
2.DNA polymerase heeft primer nodig
Trisfosfaat nucleotiden als substraat.
Koppelt monofosfaat nucleotide aan 3’-OH uiteinde.
Alleen koppeling nucleotide als er baseparing plaatsvindt.
(dus primer nodig)
DNA polymerase enzym haalt energie uit verbreken fosfaatbinding (=
energierijk).
Eén fosfaat wordt ingebouwd in DNA, pyrofosfaat komt vrij.
Snelheid tot 1000 nucleotiden per seconde in prokaryoten en tot 50 nt/s in
eukaryoten.
3. DNA (en RNA) synthese uitsluitend van 5’ naar 3’
Elongatie van 5’ naar 3’ (naar ‘rechts’) kan doorgaan als een fout verwijderd is
door de exonuclease proofreading activiteit.
Als de groei van 3’ naar 5’ (naar ‘links’) zou zijn, dan wordt door proofreading
verdere elongatie geblokkeerd omdat er geen trifosfaat (energie) meer
beschikbaar is.

DNA is anti-parallel → de replicatievork is asymmetrisch.
- leading strand & lagging strand(okazaki fragments)

,DNA polymerase(niet allemaal): Exonuclease activiteit
 Primer weghalen 3’-> 5’
 Proofreading 5’ -> 3’

DNA polymerase: polymeriseerd
 Template nodig
 Primer nodig(=stukje DNA of RNA), aan het 3’OH uiteinde
 Synthetiseren DNA van 5’ naar 3’
 Exonuclease activiteit

Replicatie fout door tautomerisering: Tautomeren
G en T bestaan in keto en enol vormen
A en C bestaan in amino en imino vorm
in cel bijna uitsluitend één tautomeer vorm aanwezig, die normaal basepaart
heel soms ontstaat (tijdelijk) de andere tautomeer
in replicatievork: verkeerde baseparing (bijv enol-T ipv C)
juiste tautomeer ontstaat later spontaan (enol-T wordt weer T)
mismatch (T tegenover G)
Moet hersteld worden door exonuclease activiteit van DNA polymerase, of door
een repair mechanisme

Proofreading:
 Baseparing (H-bruggen) van laatst aangebrachte nucleotide absoluut
noodzakelijk voor DNA polymerase.
 Mismatch door tautomerisering → DNA polymerase stopt.
 Ander deel (aparte subunit of domein) verwijderd nucleotide weer.
 Opnieuw nucleotide aangebracht.
 Zowel in prokaryoten als eukaryoten.

Mismatch(soort andere vorm helix):
 MutS herkent mismatch
 Vers gerepliceerd DNA bevat nog “nicks” (nog geen ligase langs
geweest). MutL herkent dit (zowel prokaryoten als eukaryoten). MutL knipt
foute streng weg en dan kan DNA polymerase weer binden
 Alleen bij prokaryoten: Vers gerepliceerd DNA heeft nog geen
gemethyleerde GA*TC.
De niet gemethyleerde DNA streng wordt geknipt (nick) door Mut H.
 Afbraak deel nieuwe streng(nuclease)
 Opnieuw DNA polymerase activiteit
 Zowel in pro als eukaryoten

Strand-directed mismatch repair: prokaryoten gemethyleerde Adenosine
 MutS herkent
 Vers gerepliceerd DNA heeft nog geen gemethyleerde A in de
sequentie GA*TC (prokaryoten). Extra enzym MutH knipt niet-
gemethyleerde A in de GATC sequentie, daarna volgt rest van het proces

Herstel replicatie fout door tautomerisering
Nieuw gevormd DNA moet gecontroleerd worden op replicatie fouten mbv:
1. Als DNA polymerase nog op de plek van replicatie is, en er wordt een
verkeerde nucleotide ingebouwd, dan kan mbv

, exonuclease activiteit van DNA polymerase van 3’ → 5’ (proofreading)
de fout hersteld worden.
2. Strand-directed mismatch repair:
- MutS herkent mismatch
- MutL scant het DNA op nabijgelegen “nick”.
Nicks zijn vaker aanwezig in de nieuw gevormde streng, op die manier
maakt dit complex onderscheid tussen de oude streng en de nieuw gevormde
streng. MutL triggert de degradatie van de nicked-strand.

1 fout in 109 nucleotide

DNA polymerase delta zorgt voor proofreading 3’ -> 5’
Alleen DNA polymerase I (bacteriën) heeft 5’ -> 3’ exonuclease activiteit(primer
weghalen)

Replicatie bacterie:
Eén ORI in prokaryote genomen.
Alleen ‘aktivatie’ indien er voldoende voedingsstoffen aanwezig zijn voor een
volledige celdeling.
Replicatie van E. coli genoom (4.6x106 bp) is binnen 40 min voltooid.
Na replicatie treedt celdeling op.

Replicatie is (meestal) bidirectioneel.
Replicatie begint bij specifieke DNA sequentie: Origin of Replication (ORI)
Bepaalde initiator proteins herkennen ORI en binden eraan.
Openbreken dubbele helix en primase aktiviteit → replication bubble.

DNA open, soort oog, dan primers er op, leading, laggingstrand

ORI:
 Vijf 9 nucleotide repeats:DnaA bindt hieraan
 Drie 13 nucleotide repeats: A=T rijk gebied -> makkelijk openbreken door
torsiale kracht die ontstaat door DnaA. DnaA bindt ATP,dan kan ATP dnaB
dnaC binden,primase bindt aan prepriming complex ,zet om naar
primosoom die primers maakt

DnaA: initiator eiwit
Bindt aan specifieke sequentie → torsiale stress  DNA breekt open op AT rijke
sequentie.
Dna B: helicase
Bindt aan het enkelstrengs DNA m.b.v. DnaC.
DnaC: helicase loading protein
Blokkeert het helicase, totdat het correct geplaatst is op de ORI.
DnaG: primase
Plaats primer op enkelstrengs DNA.

DNaA is gebonden, helicase bindt, helicase loading protein verdwijnt, DNA streng
wordt geopend, DNA primase bindt, DNA polymerase begint

Ori een keer actief per celdeling:
Bij prokaryoten:
Zolang DNA hemimethylated is, is er een inhibitor eiwit gebonden aan de ORI.
Na methylering van de A’s in GATC sequenties door een DNA methylase (Dam
methylase), kan de ORI opnieuw gebruikt worden.

, N.B. Het ontbreken van gemethyleerde A’s wordt door het DNA mismatch repair
systeem gebruikt om onderscheid te maken tussen de nieuw gevormde en de
oude streng.


Celdeling:
Interfase S-fase enz
Tijdens de S-fase (Synthese) worden chromosomen gerepliceerd.
Tijdens de M-fase (Mitose) worden de chromosomen verdeeld over de
dochtercellen.
G2: 1 chromosoom bestaat uit 2 chromatiden
Centromeer=waar chromosomen aan elkaar zitten
Ori=begint replicatie

Eukaryote chromosomen bevatten vele ORI’s (10.000 in het humane genoom):
- ORI’s komen voor in clusters (replication units) van 20 à 80 stuks.
- ORI’s binnen een cluster liggen 30.000 tot 250.000 bp uit elkaar.
ORI aktivatie vindt niet willekeurig plaats, maar in een vaste volgorde →
euchromatine wordt eerst gerepliceerd, daarna pas heterochromatine.
Replicatievorken stoppen pas als:
- ze een volgende replicatiebubble ‘ontmoeten’
- het uiteinde van een chromosoom bereiken.
Chromosomen bevatten meer ORI’s dan strikt noodzakelijk is.

Eukaryote genomen véél groter dan prokaryote genomen en replicatievorken 10x
langzamer (door nucleosomen?) → replicatie van een gemiddeld humaan
chromosoom zou 800 uur duren indien er slechts één ORI aanwezig zou zijn.

Autonomously Replicating Sequence (ARS) = ORI. Zodra deze sequentie in een
stuk DNA wordt geplaatst kan deze repliceren (mits de juiste enzymen aanwezig
zijn).
N.B. ORI’s in zoogdieren zijn nog niet gevonden.
 bindingsplaats voor een Origin recognition complex (ORC).
 sequentie die rijk is aan A=T (gemakkelijk open te breken).
 bindingsplaats voor eiwitten die helpen om ORC aan te trekken.

Bij eukaryoten:
ORC zit gedurende de gehele celcylus gebonden aan een ORI (behalve tijdens de
replicatie van de origin zelf)
Alleen ongefosforyleerd ORC kan een prereplicative complex vormen.
Zodra een ORI is geactiveerd, en de repliciatievorken van start zijn gegaan, wordt
ORC gefosforyleerd.
Defosforylering van ORC pas aan het einde van de mitose (in de dochtercellen

Initiatie (start)
Elongatie (synthese)
Terminatie (stop)

DNA replicatie:
 Primer nodig, 3’-OH groep vrij(DNA of RNA)
 Primase maakt primer
 Synthese DNA door DNA polymerase III
 Leading lagging strand okazaki fragmenten