H1 Histologie technieken 3.2, blz. 1
– 10
Bij histologie worden microscopische structuren van weefsels en organen bestudeerd,
hiervoor worden licht microscopen en virtuele microscopen (hogere frequentie) gebruikt;
vroeger de elektron microscoop (EM), transmissie elektron microscoop (TEM) en scan
elektron microscoop (SEM) nu plaatjes met hogere resolutie met atomische kracht
microscoop (AFM) en super-resolutie microscopische technieken
Cellen kunnen bekeken worden met fluorescentie microscopie dan kijk je van boven
Fixatie zorgt ervoor dat weefsel intact blijft metabolisme wordt beëindigd, enzymen
intact blijven, ziekteverwekkers worden gedood, weefsel wordt verstevigd
Formaline wordt hiervoor veel gebruikt (formaldehyde) voorkomt dat er binnen en buiten
de cel reacties plaatsvinden met eiwitten (aminogroep)
Daarnaast gaat er in het weefsel een insluit medium waardoor het in dunne schijfjes
gesneden kan worden door een microtoom; ook worden ze gezuiverd (alcohol/paraffine) en
gedroogd; paraffine wordt verwijderd met xylol of tolueen
Daarna worden de schijfjes gefixeerd waardoor ze vast komen aan het glaasje en
verslechtering tegen wordt gegaan
Hematoxyline en eosine kleuren het weefsel
Fixatie voor elektron microscopie gebeurt met osmium(VIII)oxide
Histochemie en cytochemie zijn gebaseerd op specifieke binding van kleuren gebruik van
fluorescerende antilichamen met kleur
Grote moleculen kan je lokaliseren met autoradiografie radioactieve voorlopers van de
moleculen worden aangebracht voor de fixatie
Grote moleculen lossen niet helemaal op bij fixatie, voorbeelden zijn: nucleoproteïnen,
cytoskelet, eiwitten en fosfolipide-eiwitten
Delen hiervan gaan verloren tijdens preparatie door bv. oplossen (zoals glycogeen en
glycosaminoglycaan)
Oplosbare delen (glucose), ionen (Na/Cl) en kleine moleculen kunnen ook verloren gaan
Zure kleurstof (zoals eosine) heeft een negatieve lading [Na+ dye-]
Basische kleurstof heeft een positieve lading [dye+ Cl-]
Hematoxyline is geen van beide, maar gedraagt als basisch (bijtmiddel voor nodig)
Anionische delen hebben de fosfaatgroep van nucleïnezuren, de sulfaatgroep van
glycosaminoglycaan en de carboxyl groep van eiwitten; ze kunnen reageren met basische
kleurstof (= basofiel) zoals heterochromatine, cytoplasma en materialen buiten de cel
zoals koolhydraten en kraakbeen
Bij hoge pH zijn alle groepen geïoniseerd, bij neutraal sulfaat en fosfaat en bij lage pH alleen
sulfaat
Reactie met zure kleurstof is acidofiel zoals cytoplasmatische draden, membranen in de
cel en draden buiten de cel
Mechanisme van metachromasie is de aanwezigheid van polyelektrolyten (negatief),
hierdoor kan de kleuring dus plaatsvinden
, Periodiek-zuur-Schiff (PAS) reactie kleurt koolhydraten (glycogeen) en andere
macromoleculen zoals DNA; kan plaatsvinden door OH-groepen, NH2-groepen en
mogelijkheid om aldehyde te vormen
Bij de Feulgen reactie (onderdeel PAS) wordt de aldehyde groep van de open structuur van
DNA gebruikt (niet RNA want geen deoxyribose)
Het resultaat van de PAS-reactie is stoichiometrisch = meetbaar en evenredig met
hoeveelheid DNA
Antilichamen/stoffen (immunoglobuline) zijn glycoproteïnen die kunnen reageren op andere
eiwitten of antigenen fluorescerende kleuren (absorberen en zenden licht van bepaalde
golflengte) kunnen hier binden
Als een vreemde stof in het lichaam komt, reageren immuun cellen zoals B-lymfocyten die
antilichamen maken tegen de stof
Bij directe immunofluorescentie reageert een primaire antistof met het antigen, dit is
minder goed te zien, omdat er maar 1 kleurtje op kan, daarom kwam er indirecte
immunofluorescentie waarbij secundaire antistoffen op de primaire antistof gaan zitten (dus
meerdere dus meer uitstraling)
De indirecte is een antilichaam voor het antilichaam van bijvoorbeeld een muis die je
gebruikt, dus kan meer globaal gebruikt worden
H1 Hybridisatie 3.9, blz. 10 – 11
Hybridisatie is de mogelijkheid om interactie te krijgen tussen RNA of DNA en de
complementaire streng
Als men radioactieve labels (isotopen) toevoegt, kan je de volgorde achterhalen
Ook kunnen er fluorescerende labels toegevoegd worden (= FISH)
Eerst fixeren, dan denatureren en daarna hybridisatie
H1 Autoradiografie 3.2, blz.
11 – 12
Kleine voorlopers van grote moleculen (eiwitten) kunnen grotere structuren aantonen zo
kan de radioactiviteit hiervan opgespoord worden (als donkere plekken bij lichtmicroscoop)
Voorbeelden zijn 3H-uridine en 3H-thymidine voor RNA en DNA
H1 Licht microscopie 3.2, blz.
12 – 16
Het onderscheidend vermogen van het oog is 0,2mm
Resolutie hangt af van kijkwijze, golflengte van lichtbron, dikte, hoeveelheid en fixatie
Helder-veld microscoop bestaat uit: lichtbron, condensator lens (voor focus), objecttafel,
objectief lens (light verzamelen) en oculaire lens (beeld) dun iets bekijken
Fase contrast microscoop maakt gebruik van verschil in brekingsindex licht dat door
dichte gebieden (met hoge brekingsindex) gaat wordt afgebogen, de microscoop brengt ze
samen waardoor contrast ontstaat hoe donkerder hoe dichter
– 10
Bij histologie worden microscopische structuren van weefsels en organen bestudeerd,
hiervoor worden licht microscopen en virtuele microscopen (hogere frequentie) gebruikt;
vroeger de elektron microscoop (EM), transmissie elektron microscoop (TEM) en scan
elektron microscoop (SEM) nu plaatjes met hogere resolutie met atomische kracht
microscoop (AFM) en super-resolutie microscopische technieken
Cellen kunnen bekeken worden met fluorescentie microscopie dan kijk je van boven
Fixatie zorgt ervoor dat weefsel intact blijft metabolisme wordt beëindigd, enzymen
intact blijven, ziekteverwekkers worden gedood, weefsel wordt verstevigd
Formaline wordt hiervoor veel gebruikt (formaldehyde) voorkomt dat er binnen en buiten
de cel reacties plaatsvinden met eiwitten (aminogroep)
Daarnaast gaat er in het weefsel een insluit medium waardoor het in dunne schijfjes
gesneden kan worden door een microtoom; ook worden ze gezuiverd (alcohol/paraffine) en
gedroogd; paraffine wordt verwijderd met xylol of tolueen
Daarna worden de schijfjes gefixeerd waardoor ze vast komen aan het glaasje en
verslechtering tegen wordt gegaan
Hematoxyline en eosine kleuren het weefsel
Fixatie voor elektron microscopie gebeurt met osmium(VIII)oxide
Histochemie en cytochemie zijn gebaseerd op specifieke binding van kleuren gebruik van
fluorescerende antilichamen met kleur
Grote moleculen kan je lokaliseren met autoradiografie radioactieve voorlopers van de
moleculen worden aangebracht voor de fixatie
Grote moleculen lossen niet helemaal op bij fixatie, voorbeelden zijn: nucleoproteïnen,
cytoskelet, eiwitten en fosfolipide-eiwitten
Delen hiervan gaan verloren tijdens preparatie door bv. oplossen (zoals glycogeen en
glycosaminoglycaan)
Oplosbare delen (glucose), ionen (Na/Cl) en kleine moleculen kunnen ook verloren gaan
Zure kleurstof (zoals eosine) heeft een negatieve lading [Na+ dye-]
Basische kleurstof heeft een positieve lading [dye+ Cl-]
Hematoxyline is geen van beide, maar gedraagt als basisch (bijtmiddel voor nodig)
Anionische delen hebben de fosfaatgroep van nucleïnezuren, de sulfaatgroep van
glycosaminoglycaan en de carboxyl groep van eiwitten; ze kunnen reageren met basische
kleurstof (= basofiel) zoals heterochromatine, cytoplasma en materialen buiten de cel
zoals koolhydraten en kraakbeen
Bij hoge pH zijn alle groepen geïoniseerd, bij neutraal sulfaat en fosfaat en bij lage pH alleen
sulfaat
Reactie met zure kleurstof is acidofiel zoals cytoplasmatische draden, membranen in de
cel en draden buiten de cel
Mechanisme van metachromasie is de aanwezigheid van polyelektrolyten (negatief),
hierdoor kan de kleuring dus plaatsvinden
, Periodiek-zuur-Schiff (PAS) reactie kleurt koolhydraten (glycogeen) en andere
macromoleculen zoals DNA; kan plaatsvinden door OH-groepen, NH2-groepen en
mogelijkheid om aldehyde te vormen
Bij de Feulgen reactie (onderdeel PAS) wordt de aldehyde groep van de open structuur van
DNA gebruikt (niet RNA want geen deoxyribose)
Het resultaat van de PAS-reactie is stoichiometrisch = meetbaar en evenredig met
hoeveelheid DNA
Antilichamen/stoffen (immunoglobuline) zijn glycoproteïnen die kunnen reageren op andere
eiwitten of antigenen fluorescerende kleuren (absorberen en zenden licht van bepaalde
golflengte) kunnen hier binden
Als een vreemde stof in het lichaam komt, reageren immuun cellen zoals B-lymfocyten die
antilichamen maken tegen de stof
Bij directe immunofluorescentie reageert een primaire antistof met het antigen, dit is
minder goed te zien, omdat er maar 1 kleurtje op kan, daarom kwam er indirecte
immunofluorescentie waarbij secundaire antistoffen op de primaire antistof gaan zitten (dus
meerdere dus meer uitstraling)
De indirecte is een antilichaam voor het antilichaam van bijvoorbeeld een muis die je
gebruikt, dus kan meer globaal gebruikt worden
H1 Hybridisatie 3.9, blz. 10 – 11
Hybridisatie is de mogelijkheid om interactie te krijgen tussen RNA of DNA en de
complementaire streng
Als men radioactieve labels (isotopen) toevoegt, kan je de volgorde achterhalen
Ook kunnen er fluorescerende labels toegevoegd worden (= FISH)
Eerst fixeren, dan denatureren en daarna hybridisatie
H1 Autoradiografie 3.2, blz.
11 – 12
Kleine voorlopers van grote moleculen (eiwitten) kunnen grotere structuren aantonen zo
kan de radioactiviteit hiervan opgespoord worden (als donkere plekken bij lichtmicroscoop)
Voorbeelden zijn 3H-uridine en 3H-thymidine voor RNA en DNA
H1 Licht microscopie 3.2, blz.
12 – 16
Het onderscheidend vermogen van het oog is 0,2mm
Resolutie hangt af van kijkwijze, golflengte van lichtbron, dikte, hoeveelheid en fixatie
Helder-veld microscoop bestaat uit: lichtbron, condensator lens (voor focus), objecttafel,
objectief lens (light verzamelen) en oculaire lens (beeld) dun iets bekijken
Fase contrast microscoop maakt gebruik van verschil in brekingsindex licht dat door
dichte gebieden (met hoge brekingsindex) gaat wordt afgebogen, de microscoop brengt ze
samen waardoor contrast ontstaat hoe donkerder hoe dichter
