Klinische chemie
Hoofdstuk 4 Fotometrie
Het meten van licht of kleur
Voordelen: hoge snelheid en gevoeligheid
Zichtbaar licht - elektromagnetische golven tussen 400 en 750 nm (nanometer)
Polychromatisch licht - wit licht (mengsel met alle kleuren zichtbaar licht)
Monochromatisch licht - licht van 1 specifieke golflengte, mono is 1 - poly is veel
Emissie - uitzending licht van een lichtbron, kan bij wit of kleur licht
Geabsorbeerd: Al het licht wordt doorgelaten, niks kaatst terug =
zwart
Al het licht wordt teruggekaatst en niks doorgelaten =
wit
Complementaire kleur - de tegenovergestelde kleur van de
kleurencirkel
Lichtbron -> difragma -> monochromator -> cuvet -> fotocel
(gemeten doorgelaten licht -> signaalversterker -> meter
- Invallende licht gaan door cuvet en uittredende licht
na absorptie wordt gemeten
Cuvetten
- Is een reactievaatje -> rechthoekig buisje, waarin zich te meten oplossing
bevindt.
- Diameter cuvet = 1 cm
- Materiaal: kwartsglas (kan ook plastic of glas) -> afhankelijk van licht-
golflengte
- Kwarts -> bij metingen in het UV-gebied
- Glazen of plastic -> bij metingen in zichtbaar gebied tussen 400 en 750 nm
- Glas en plastic absorberen te veel UV-licht
De wet van Lambert-Beer
Relatie van extinctie en concentratie
Transmissie en extinctie
%T = I/I0 x 100
Waarin:
T = transmissie
I = intensiteit van het uitredende licht
I = intensiteit van het uitvallende licht
Extinctie - absorptie (uitdoving) van het licht
De extinctie wordt berekend uit de transmissie:
E = 2 – log %T
E=ε xcxl
, E = Extinctie
ε = molaire extinctie coëfficiënt in L mol-1 cm-1
C = concentratie in Mol/l
L = weglengte in cm (cuvet dikte)
De molaire extinctie coëfficiënt en weglengte is vast, loopt het uit op een lineaire
verband door de wet van lambert-beer.
! De wet van lambert-beer is alleen geldig voor monochromatisch licht -> 1
golflengte !
De wet van lambert-beer is niet betrouwbaar door:
- Geen monochromatisch licht, maar licht met golflengtes die dicht op elkaar
liggen
- Absorptie door andere kleurstoffen
- Fotometer werkt nooit 100% optimaal
Dit wordt opgelost om een ijklijn te maken
- Extincties worden uitgezet tegen bij behorende concentraties
- Met extinctie van te meten stof kan de concentratie afgelezen worden
Het absorptiespectrum
Een stof absorbeert niet 1 specifieke golflengte, maar meer
golflengtes
- Absorptiespectrum is karakteristiek -> gebruikt worden voor een stof te
identificeren
- Ook het bepalen van een golflengte door een fotometrische bepaling
- Absorptie maximum gebruiken voor een meting
Hoogste gevoeligheid en extinctie, varieert niet sterk met de
golflengte
- Als een andere stof dezelfde hoogte absorptie heeft, kies dan een andere
plek
Problemen bij fotometrische bepaling
- Reagens blanco -> alles behalve de bepalende stof
- Monster blanco -> extinctie van het monster (verdund met reagens)
gemeten voor de reactie
Egecorrigeerd = Egemeten – Ereagens – Emonster
Zoals: troebeling (door aanwezigheid van vet) of afwijkende kleur of hemoglobine
door kapotte cellen (hemolytische monsters) en bilirubine (icterische monsters)
Hemolytisch -> kapotte rode bloedcellen -> hemoglobine in het monster
met rode kleur
Icterisch -> bilirubine (hoge concentratie) -> gele kleur
Lipemie -> aanwezigheid van heel veel vet
Absorptiespectrum
- Hoogste piek waar er het beste op gemeten kan worden bij verschillende
golflengtes
Hoofdstuk 4 Fotometrie
Het meten van licht of kleur
Voordelen: hoge snelheid en gevoeligheid
Zichtbaar licht - elektromagnetische golven tussen 400 en 750 nm (nanometer)
Polychromatisch licht - wit licht (mengsel met alle kleuren zichtbaar licht)
Monochromatisch licht - licht van 1 specifieke golflengte, mono is 1 - poly is veel
Emissie - uitzending licht van een lichtbron, kan bij wit of kleur licht
Geabsorbeerd: Al het licht wordt doorgelaten, niks kaatst terug =
zwart
Al het licht wordt teruggekaatst en niks doorgelaten =
wit
Complementaire kleur - de tegenovergestelde kleur van de
kleurencirkel
Lichtbron -> difragma -> monochromator -> cuvet -> fotocel
(gemeten doorgelaten licht -> signaalversterker -> meter
- Invallende licht gaan door cuvet en uittredende licht
na absorptie wordt gemeten
Cuvetten
- Is een reactievaatje -> rechthoekig buisje, waarin zich te meten oplossing
bevindt.
- Diameter cuvet = 1 cm
- Materiaal: kwartsglas (kan ook plastic of glas) -> afhankelijk van licht-
golflengte
- Kwarts -> bij metingen in het UV-gebied
- Glazen of plastic -> bij metingen in zichtbaar gebied tussen 400 en 750 nm
- Glas en plastic absorberen te veel UV-licht
De wet van Lambert-Beer
Relatie van extinctie en concentratie
Transmissie en extinctie
%T = I/I0 x 100
Waarin:
T = transmissie
I = intensiteit van het uitredende licht
I = intensiteit van het uitvallende licht
Extinctie - absorptie (uitdoving) van het licht
De extinctie wordt berekend uit de transmissie:
E = 2 – log %T
E=ε xcxl
, E = Extinctie
ε = molaire extinctie coëfficiënt in L mol-1 cm-1
C = concentratie in Mol/l
L = weglengte in cm (cuvet dikte)
De molaire extinctie coëfficiënt en weglengte is vast, loopt het uit op een lineaire
verband door de wet van lambert-beer.
! De wet van lambert-beer is alleen geldig voor monochromatisch licht -> 1
golflengte !
De wet van lambert-beer is niet betrouwbaar door:
- Geen monochromatisch licht, maar licht met golflengtes die dicht op elkaar
liggen
- Absorptie door andere kleurstoffen
- Fotometer werkt nooit 100% optimaal
Dit wordt opgelost om een ijklijn te maken
- Extincties worden uitgezet tegen bij behorende concentraties
- Met extinctie van te meten stof kan de concentratie afgelezen worden
Het absorptiespectrum
Een stof absorbeert niet 1 specifieke golflengte, maar meer
golflengtes
- Absorptiespectrum is karakteristiek -> gebruikt worden voor een stof te
identificeren
- Ook het bepalen van een golflengte door een fotometrische bepaling
- Absorptie maximum gebruiken voor een meting
Hoogste gevoeligheid en extinctie, varieert niet sterk met de
golflengte
- Als een andere stof dezelfde hoogte absorptie heeft, kies dan een andere
plek
Problemen bij fotometrische bepaling
- Reagens blanco -> alles behalve de bepalende stof
- Monster blanco -> extinctie van het monster (verdund met reagens)
gemeten voor de reactie
Egecorrigeerd = Egemeten – Ereagens – Emonster
Zoals: troebeling (door aanwezigheid van vet) of afwijkende kleur of hemoglobine
door kapotte cellen (hemolytische monsters) en bilirubine (icterische monsters)
Hemolytisch -> kapotte rode bloedcellen -> hemoglobine in het monster
met rode kleur
Icterisch -> bilirubine (hoge concentratie) -> gele kleur
Lipemie -> aanwezigheid van heel veel vet
Absorptiespectrum
- Hoogste piek waar er het beste op gemeten kan worden bij verschillende
golflengtes
