Moleculaire biologie les 1
CFTR eiwit
Bij cystic fibrose (taaislijmziekte) is het slijm in de longen, keel en darmen taai en dik. Deze
ziekte wordt veroorzaakt door een fout in het CFTR eiwit. Het CFTR eiwit zorgt voor actief
transport van CI- naar de mucuslaag. Via passief transport en osmose komt er ook Na + en
H2O in de mucuslaag. Dit is
belangrijk voor de hydratatie van de
mucuslaag om zich te kunnen
beschermen tegen infecties, de
slijmlaag kan zo makkelijk gevangen
bacteriën afvoeren.
Bij een gemuteerd CFTR eiwit is de actieve transport van CI - verminderd waardoor Na+ wordt
gereabsorbeerd en H2O door osmose in
de cel blijft. De slijmlaag wordt taai
waardoor gevangen bacteriën niet
goed afgevoerd kunnen worden, dit
verhoogt de kans op infecties.
CFTR is autosomaal recessief, dit betekend dat je de aandoening krijgt wanneer je van ieder
ouder het recessieve gen overerft. Er zijn meer dan 2500 CFTR mutaties bekend.
DNA
DNA is opgebouwd uit nucleotiden. Een nucleotide
bestaat uit drie onderdelen: een suiker (deoxyribose),
een fosfaatgroep (gehecht aan plek 5) en een base
(gehecht aan plek 1). De meest voorkomende base zijn:
adenine, guanine, cytosine, thymine en uracil. Adenine
en thymine zijn verbonden door twee waterstofbruggen
en guanine en cytosine door drie waterstofbruggen.
Purine (dubbele ring): adenine & guanine
Pyrimidine (enkele ring): cytosine & thymine
DNA polymerase
DNA polymerase is een eiwit die betrokken is bij de DNA-replicatie. DNA polymerase koppelt
nucleotide aan de 3’ kant van de streng, het werkt dus van de 5’ 3’. Om dit te kunnen
doen heeft DNA polymerase een paar dingen nodig: het heeft een matrijs/template streng
nodig en begin stukje nodig om aan te koppelen (primer). Replicatie vind plaats in de S-fase.
Sommige DNA polymerasen hebben een exonuclease activiteit. Dit betekend dat ze de
laatst gekoppelde nucleotide kunnen verwijderen (5’ 3’) en om de RNA primer te
verwijderen. Bij proofreading wordt de hele streng gecontroleerd op foutjes (3’ 5’).
,PCR
Polymerase chain reaction (PCR) toont specifiek stukjes genetisch materiaal. Nodig voor de
reactiemix zijn:
DNA met target sequentie
Primer paar (beide kanten!)
Taq polymerase
Voldoende nucleotiden (A, C, G, T’s, ook wel dNTPs) Trifosfaat-deoxyribonucleotiden
Reactiebuffer (o.a. MgCl2)
De PCR bestaat uit drie stappen: denaturatie, annealing en emulgatie. Tijdens denaturatie
(94ºC) splitsen de twee DNA strengen van elkaar. Tijdens de anneling (50-60 ºC) binden de
primers (5’ 3’), zij geven het begin en eind aan van het stuk DNA dat wordt gekopieerd.
Tot slot de emulgatie (72ºC), tijdens deze stap wordt het DNA verdubbeld door taq
polymerase, complementaire basen worden gekoppeld aan de template streng.
Gewenste product na 3 cycli.
, Forward en reverse primer
Nieuwe nucleotide worden aan de 3’ kant toegevoegd door DNA polymerase. De DNA streng
wordt dus langer aan de 3’ kant (5’ 3’). Primers worden niet hergebruikt, ze worden deel
van de DNA keten. Primers kunnen ook niet loslaten ookal stijgt de temperatuur, ze zitten al
vast door het taq polymerase.
Forward primer: 5’- GCTATCCAGAAC – 3’
Reverse primer: 3’- GATGACTATACC – 5’
CFTR eiwit
Bij cystic fibrose (taaislijmziekte) is het slijm in de longen, keel en darmen taai en dik. Deze
ziekte wordt veroorzaakt door een fout in het CFTR eiwit. Het CFTR eiwit zorgt voor actief
transport van CI- naar de mucuslaag. Via passief transport en osmose komt er ook Na + en
H2O in de mucuslaag. Dit is
belangrijk voor de hydratatie van de
mucuslaag om zich te kunnen
beschermen tegen infecties, de
slijmlaag kan zo makkelijk gevangen
bacteriën afvoeren.
Bij een gemuteerd CFTR eiwit is de actieve transport van CI - verminderd waardoor Na+ wordt
gereabsorbeerd en H2O door osmose in
de cel blijft. De slijmlaag wordt taai
waardoor gevangen bacteriën niet
goed afgevoerd kunnen worden, dit
verhoogt de kans op infecties.
CFTR is autosomaal recessief, dit betekend dat je de aandoening krijgt wanneer je van ieder
ouder het recessieve gen overerft. Er zijn meer dan 2500 CFTR mutaties bekend.
DNA
DNA is opgebouwd uit nucleotiden. Een nucleotide
bestaat uit drie onderdelen: een suiker (deoxyribose),
een fosfaatgroep (gehecht aan plek 5) en een base
(gehecht aan plek 1). De meest voorkomende base zijn:
adenine, guanine, cytosine, thymine en uracil. Adenine
en thymine zijn verbonden door twee waterstofbruggen
en guanine en cytosine door drie waterstofbruggen.
Purine (dubbele ring): adenine & guanine
Pyrimidine (enkele ring): cytosine & thymine
DNA polymerase
DNA polymerase is een eiwit die betrokken is bij de DNA-replicatie. DNA polymerase koppelt
nucleotide aan de 3’ kant van de streng, het werkt dus van de 5’ 3’. Om dit te kunnen
doen heeft DNA polymerase een paar dingen nodig: het heeft een matrijs/template streng
nodig en begin stukje nodig om aan te koppelen (primer). Replicatie vind plaats in de S-fase.
Sommige DNA polymerasen hebben een exonuclease activiteit. Dit betekend dat ze de
laatst gekoppelde nucleotide kunnen verwijderen (5’ 3’) en om de RNA primer te
verwijderen. Bij proofreading wordt de hele streng gecontroleerd op foutjes (3’ 5’).
,PCR
Polymerase chain reaction (PCR) toont specifiek stukjes genetisch materiaal. Nodig voor de
reactiemix zijn:
DNA met target sequentie
Primer paar (beide kanten!)
Taq polymerase
Voldoende nucleotiden (A, C, G, T’s, ook wel dNTPs) Trifosfaat-deoxyribonucleotiden
Reactiebuffer (o.a. MgCl2)
De PCR bestaat uit drie stappen: denaturatie, annealing en emulgatie. Tijdens denaturatie
(94ºC) splitsen de twee DNA strengen van elkaar. Tijdens de anneling (50-60 ºC) binden de
primers (5’ 3’), zij geven het begin en eind aan van het stuk DNA dat wordt gekopieerd.
Tot slot de emulgatie (72ºC), tijdens deze stap wordt het DNA verdubbeld door taq
polymerase, complementaire basen worden gekoppeld aan de template streng.
Gewenste product na 3 cycli.
, Forward en reverse primer
Nieuwe nucleotide worden aan de 3’ kant toegevoegd door DNA polymerase. De DNA streng
wordt dus langer aan de 3’ kant (5’ 3’). Primers worden niet hergebruikt, ze worden deel
van de DNA keten. Primers kunnen ook niet loslaten ookal stijgt de temperatuur, ze zitten al
vast door het taq polymerase.
Forward primer: 5’- GCTATCCAGAAC – 3’
Reverse primer: 3’- GATGACTATACC – 5’
