CM Werkcolleges
Werkcollege 1 Buffers A
M mM μM nM pM
10-3 10-6 10-9 10-12
Opgave 1 Geschiktheid van buffers
1a Bij de aanvang is de pH van de cellen en het medium 7.4, namelijk tussen 7.35 en 7.45. De
concentratie H+-ionen is dus 10-pH = 10-7.4 = 39.8 nM = 40 nM. De cellen zullen sterven wanneer de [H +]
= 10-7 = 100 nM, dus als de molariteit is toegenomen met 100 – 40 = 60 nM. Dit komt overeen met 60
x 10-12 mol/ml. De gemiddelde productie van H+ is 10-15 mol per minuut per cel. Dus 1000 cellen
produceren 10-12 mol per minuut. Dat zit in 1 ml. Daarom zullen de cellen beginnen met afsterven na
60 minuten. Stel dat de cellen niet zouden afsterven, maar gewoon met dezelfde snelheid door
zouden gaan H+ te produceren. Dan zou je na 48 uur de [H +] in het medium 10-12 x 60 x 48 = 2.9
nM/mL zijn, dit in liter, dus 3 μM/L, dus de pH zou 5.5 zijn.
1b
Buffer pK [base] μM [zuur] μM Begin pH pH na 48 uur
X 4.8 400 1 7.4 6.8
Y 7.8 115 285 7.4 7.4
Z 9.4 4 400 7.4 6.8
1c Bij buffer Y, want daar is er een afname van 0 eenheden, bij de rest is een afname van meer dan
0.4 eenheden.
1d De bufferconcentratie van X is 401 μM/L, van Y is 400 μM/L, van Z 404 μM/L. De verschillen in pH
verandering wordne dus niet veroorzaakt door verschillen in concentratie van de buffers.
1e De pH bij aanvang is dan 7.4. De pH na 48 uur is dan 7.04.
1f Doordat er een betere verhouding [base] [zuur] aanwezig is in de buffer, De pK waarde ligt het
dichtste bij de pH, er is een betere verhouding [base] en [zuur] aanwezig is, en p heeft weinig
invloed.
1g
Aantal cellen per Stijging [H+] μM [base] μM na 48 [zuur] μM na 48 pH na 48 uur
mL na 48 uur uur uur
1 000 3 112 288 7.4
10 000 30 85 315 7.2
20 000 60 55 345 7.0
1j Je moet meer buffer toevoegen.
Opgave 2 De bufferende werking van eiwitten en het iso-ëlectrisch punt van eiwitten
2a Om eiwitten aan elkaar te koppelen, wordt water afgesplitst en verliest NH 3+ een H-atoom en
COOH verliest OH-, water wordt dus afgesplitst.
2b Glycine: 1.4-3.4 en 8.8-10.8; Histidine: 0.8-2.8 en 5-7 en 8.2-10.2; Aspartaat: 1-4.9 en 9-11 ; Lysine:
1.2-3.2 en 8.2-11.8
2c Bij pH = 4: aspartaat en glutamaat. Bij pH = 6: histadine. Bij pH = 9: alanine, glycine, pheylalanine,
serine, valine, glutamaat, histidine, cysteïne, tyroisine, lysine, arginine. Bij pH = 12: ariginine.
2d De buffercapaciteit van een oplossing van een eiwit is minder goed dan de buffercapiciteit van
een oplossing van aminozuren in vrije vorm, want zij hebben meer vrije α-COOH en α-NH3+, want die
zijn enkel gelegen aan de uiteinden van een eiwit.
,Werkcollege 2 Buffers B
Opgave 1
1a Het IEP is de pH waarbij de netto lading van een eiwit 0 is, dus er zijn evenveel positief als negatief
geladen groepen. Bij een hogere pH dan het IEP kan een eiwit een H + afstaan, waardoor het eiwit
negatief geladen wordt als geheel. Bij een lagere pH dan het IEP kan een eiwit een H + opnemen en
wordt positief geladen als geheel. Water heeft een dipoolmoment, waardoor het eiwit daar beter
een interactie kan vormen. Ook heeft een eiwit een kleinere watermantel bij de IEP.
[B ]
1b pH = pK + log -> altijd pK = 2, want je wilt verhouding [B]/[Z] en niet [Z]/[B].
[ Z]
Lading 100+ 100+ 90+ 50+ 10+ 0 0 0 0 0 10- 50- 90- 100-
pH -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Opgave 2
2a
pH = 1 pH = 4 pH = 6 pH = 8
1 aminoterminaal 1+ 1+ 1+ 1+
1 carboxyterminaal 0 1- 1- 1-
10 serines 0 0 0 0
10 arginines 10+ 10+ 10+ 10+
8 alanines 0 0 0 0
22 histidines 22+ 22+ 11+ 0
2 cysteïnes 0 0 0 0
27 aspartaat 0 14- 27- 27-
15 lysines 15+ 15+ 15+ 15+
2 tyrosines 0 0 0 0
25 glutamines 0 0 0 0
Totale netto lading 48+ 33+ 9+ 2-
2b Histidine, want die verandert van lading bij een pH van 7-7,8.
2c Tussen pH 6 en pH8, maar meer richting 8, rond 7,5 pH.
2d Je hebt een bak met een buffer, als het eiwit erop blijft liggen, dan is IEP gehaald.
2e Bij een experiment kunnen hoeveelheden van stroom/eiwitten etc. afwijken, terwijl het bij een
formule altijd dezelfde hoeveelheden zijn. Er ontstaan dus meetfouten bij een experiment. Als je het
heel vaak doet krijg je het probleem dat eiwit een bolletje is, waar in het midden geen water zit,
hierdoor reageert alleen de buitenkant van het eiwit reageert met de buffer, waardoor die het IEP
bepaalt.
2f (Berekenen IEP): lading moet 0 worden, hiervoor moet histidine compenseren voor de negatieve
ladingen, dit kan met histidine, je moet dus histidine lading op 2+ laden, want de rest blijft gelijk.
Doordat je 22 histidines heb, heb je 2 zure vormen en 20 basische vormen, dus krijg je:
20
pH =6+ log =6 +log 10=7 .
2
Opgave 3
8 8
3a Je weet: pK = 6.1, pH = 7.1, [base] = 8 mM, dus: 7.1=6.1+ log , dus: 1=log , dus
[zuur ] [zuur]
1 8 8
dan geldt: 10 = , dus: [ zuur ] = . Dus [CO2] = 0.8 mM.
[zuur] 10
, 3b Je wilt [HCO3-] weten, je hebt: pK = 6.1; pH = 7.03 en [CO 2] = 1.2 mM. Dus geldt:
[base] [base] 0.93 [base ]
7.03=6.1+ log , hieruit volgt: 0.93=log , dus geldt: 10 = , dus geldt:
1.1 1.1 1.1
[ base ] =1.1• 100.93, dus [HCO3-] is dan 9.4 mM. De normaalwaarde van [HCO3-] is 24.0 mM, nu is die
waarde 9.4, dus het verschil is: 14.6 mM, dit is gebruikt om het zuur te bufferen wat de acidose
veroorzaakt.
Werkcollege 3 Enzymkinetiek
Gekozen enzym: alpha-amylase-(EC 3.2.1.1)
Eiwitconcentratie: 7.13 mg (eiwit) ml-1
Specifieke activiteit: 0.035 mml (product)/mg(eiwit)/minuut
1a Met behulp van de specifieke activiteit en de eiwitconcentratie kun je uitrekenen vwat de
activiteit van 1 mL enzymoplossing is in (mmol min -1 ml-1).
7.13 • 0.035 = 0.2496 mmol min-1 ml-1.
1b Wat is de activiteit van 1 μl oplossing?
0.2496 mmol min-1 ml-1 = 0.2496 μmol min-1 μl-1
2 Nu je de activiteit van 1 μl enzymoplossing weet, kun je ook uitrekenen hoeveel μl enzymoplossing
je nodig hebt om de maximaal te meten snelheid (10 μmol min-1) te bereiken. Hoeveel μl oplossing
heeft u dus nodig om een activiteit van 10 μmol min -1 te krijgen?
10/0.2496 = 40.06 μl.
Dit enzymvolume heeft bij de standaard condities (pH 7 en een substraatconcentratie van 20 mM, zie
“Kies een enzym”) een activiteit die net binnen het meetbereik valt. Kies voor je experiment
ongeveer de helft van dit volume.
3 Waarom de helft en niet precies dit volume
(bedenk dat je de optimum pH gaat bepalen)?
Wanneer je teveel of te weinig enzymvolume
hebt gekozen, zal de analyse bij bepaalde
metingen aangeven dat de meetwaarde buiten
het te meten bereik valt. Je moet dan je
volledige analyse opnieuw uitvoeren met een
ander enzymvolume.
Experiment met verschillende pH-waarden:
pH 4 5 6 7 8 9 1 1
0 1
Activiteit T 6 9 9 6 T T T
(μmol/min) e . . . . e e e
meting 1 la 3 5 7 7 la la la
a 9 9 4 0 a a a
g 1 7 9 3 g g g
Activiteit T 6 9 9 6 T T T
(μmol/min) e . . . . e e e
meting 2 la 5 5 8 5 la la la
a 6 3 7 9 a a a
Werkcollege 1 Buffers A
M mM μM nM pM
10-3 10-6 10-9 10-12
Opgave 1 Geschiktheid van buffers
1a Bij de aanvang is de pH van de cellen en het medium 7.4, namelijk tussen 7.35 en 7.45. De
concentratie H+-ionen is dus 10-pH = 10-7.4 = 39.8 nM = 40 nM. De cellen zullen sterven wanneer de [H +]
= 10-7 = 100 nM, dus als de molariteit is toegenomen met 100 – 40 = 60 nM. Dit komt overeen met 60
x 10-12 mol/ml. De gemiddelde productie van H+ is 10-15 mol per minuut per cel. Dus 1000 cellen
produceren 10-12 mol per minuut. Dat zit in 1 ml. Daarom zullen de cellen beginnen met afsterven na
60 minuten. Stel dat de cellen niet zouden afsterven, maar gewoon met dezelfde snelheid door
zouden gaan H+ te produceren. Dan zou je na 48 uur de [H +] in het medium 10-12 x 60 x 48 = 2.9
nM/mL zijn, dit in liter, dus 3 μM/L, dus de pH zou 5.5 zijn.
1b
Buffer pK [base] μM [zuur] μM Begin pH pH na 48 uur
X 4.8 400 1 7.4 6.8
Y 7.8 115 285 7.4 7.4
Z 9.4 4 400 7.4 6.8
1c Bij buffer Y, want daar is er een afname van 0 eenheden, bij de rest is een afname van meer dan
0.4 eenheden.
1d De bufferconcentratie van X is 401 μM/L, van Y is 400 μM/L, van Z 404 μM/L. De verschillen in pH
verandering wordne dus niet veroorzaakt door verschillen in concentratie van de buffers.
1e De pH bij aanvang is dan 7.4. De pH na 48 uur is dan 7.04.
1f Doordat er een betere verhouding [base] [zuur] aanwezig is in de buffer, De pK waarde ligt het
dichtste bij de pH, er is een betere verhouding [base] en [zuur] aanwezig is, en p heeft weinig
invloed.
1g
Aantal cellen per Stijging [H+] μM [base] μM na 48 [zuur] μM na 48 pH na 48 uur
mL na 48 uur uur uur
1 000 3 112 288 7.4
10 000 30 85 315 7.2
20 000 60 55 345 7.0
1j Je moet meer buffer toevoegen.
Opgave 2 De bufferende werking van eiwitten en het iso-ëlectrisch punt van eiwitten
2a Om eiwitten aan elkaar te koppelen, wordt water afgesplitst en verliest NH 3+ een H-atoom en
COOH verliest OH-, water wordt dus afgesplitst.
2b Glycine: 1.4-3.4 en 8.8-10.8; Histidine: 0.8-2.8 en 5-7 en 8.2-10.2; Aspartaat: 1-4.9 en 9-11 ; Lysine:
1.2-3.2 en 8.2-11.8
2c Bij pH = 4: aspartaat en glutamaat. Bij pH = 6: histadine. Bij pH = 9: alanine, glycine, pheylalanine,
serine, valine, glutamaat, histidine, cysteïne, tyroisine, lysine, arginine. Bij pH = 12: ariginine.
2d De buffercapaciteit van een oplossing van een eiwit is minder goed dan de buffercapiciteit van
een oplossing van aminozuren in vrije vorm, want zij hebben meer vrije α-COOH en α-NH3+, want die
zijn enkel gelegen aan de uiteinden van een eiwit.
,Werkcollege 2 Buffers B
Opgave 1
1a Het IEP is de pH waarbij de netto lading van een eiwit 0 is, dus er zijn evenveel positief als negatief
geladen groepen. Bij een hogere pH dan het IEP kan een eiwit een H + afstaan, waardoor het eiwit
negatief geladen wordt als geheel. Bij een lagere pH dan het IEP kan een eiwit een H + opnemen en
wordt positief geladen als geheel. Water heeft een dipoolmoment, waardoor het eiwit daar beter
een interactie kan vormen. Ook heeft een eiwit een kleinere watermantel bij de IEP.
[B ]
1b pH = pK + log -> altijd pK = 2, want je wilt verhouding [B]/[Z] en niet [Z]/[B].
[ Z]
Lading 100+ 100+ 90+ 50+ 10+ 0 0 0 0 0 10- 50- 90- 100-
pH -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Opgave 2
2a
pH = 1 pH = 4 pH = 6 pH = 8
1 aminoterminaal 1+ 1+ 1+ 1+
1 carboxyterminaal 0 1- 1- 1-
10 serines 0 0 0 0
10 arginines 10+ 10+ 10+ 10+
8 alanines 0 0 0 0
22 histidines 22+ 22+ 11+ 0
2 cysteïnes 0 0 0 0
27 aspartaat 0 14- 27- 27-
15 lysines 15+ 15+ 15+ 15+
2 tyrosines 0 0 0 0
25 glutamines 0 0 0 0
Totale netto lading 48+ 33+ 9+ 2-
2b Histidine, want die verandert van lading bij een pH van 7-7,8.
2c Tussen pH 6 en pH8, maar meer richting 8, rond 7,5 pH.
2d Je hebt een bak met een buffer, als het eiwit erop blijft liggen, dan is IEP gehaald.
2e Bij een experiment kunnen hoeveelheden van stroom/eiwitten etc. afwijken, terwijl het bij een
formule altijd dezelfde hoeveelheden zijn. Er ontstaan dus meetfouten bij een experiment. Als je het
heel vaak doet krijg je het probleem dat eiwit een bolletje is, waar in het midden geen water zit,
hierdoor reageert alleen de buitenkant van het eiwit reageert met de buffer, waardoor die het IEP
bepaalt.
2f (Berekenen IEP): lading moet 0 worden, hiervoor moet histidine compenseren voor de negatieve
ladingen, dit kan met histidine, je moet dus histidine lading op 2+ laden, want de rest blijft gelijk.
Doordat je 22 histidines heb, heb je 2 zure vormen en 20 basische vormen, dus krijg je:
20
pH =6+ log =6 +log 10=7 .
2
Opgave 3
8 8
3a Je weet: pK = 6.1, pH = 7.1, [base] = 8 mM, dus: 7.1=6.1+ log , dus: 1=log , dus
[zuur ] [zuur]
1 8 8
dan geldt: 10 = , dus: [ zuur ] = . Dus [CO2] = 0.8 mM.
[zuur] 10
, 3b Je wilt [HCO3-] weten, je hebt: pK = 6.1; pH = 7.03 en [CO 2] = 1.2 mM. Dus geldt:
[base] [base] 0.93 [base ]
7.03=6.1+ log , hieruit volgt: 0.93=log , dus geldt: 10 = , dus geldt:
1.1 1.1 1.1
[ base ] =1.1• 100.93, dus [HCO3-] is dan 9.4 mM. De normaalwaarde van [HCO3-] is 24.0 mM, nu is die
waarde 9.4, dus het verschil is: 14.6 mM, dit is gebruikt om het zuur te bufferen wat de acidose
veroorzaakt.
Werkcollege 3 Enzymkinetiek
Gekozen enzym: alpha-amylase-(EC 3.2.1.1)
Eiwitconcentratie: 7.13 mg (eiwit) ml-1
Specifieke activiteit: 0.035 mml (product)/mg(eiwit)/minuut
1a Met behulp van de specifieke activiteit en de eiwitconcentratie kun je uitrekenen vwat de
activiteit van 1 mL enzymoplossing is in (mmol min -1 ml-1).
7.13 • 0.035 = 0.2496 mmol min-1 ml-1.
1b Wat is de activiteit van 1 μl oplossing?
0.2496 mmol min-1 ml-1 = 0.2496 μmol min-1 μl-1
2 Nu je de activiteit van 1 μl enzymoplossing weet, kun je ook uitrekenen hoeveel μl enzymoplossing
je nodig hebt om de maximaal te meten snelheid (10 μmol min-1) te bereiken. Hoeveel μl oplossing
heeft u dus nodig om een activiteit van 10 μmol min -1 te krijgen?
10/0.2496 = 40.06 μl.
Dit enzymvolume heeft bij de standaard condities (pH 7 en een substraatconcentratie van 20 mM, zie
“Kies een enzym”) een activiteit die net binnen het meetbereik valt. Kies voor je experiment
ongeveer de helft van dit volume.
3 Waarom de helft en niet precies dit volume
(bedenk dat je de optimum pH gaat bepalen)?
Wanneer je teveel of te weinig enzymvolume
hebt gekozen, zal de analyse bij bepaalde
metingen aangeven dat de meetwaarde buiten
het te meten bereik valt. Je moet dan je
volledige analyse opnieuw uitvoeren met een
ander enzymvolume.
Experiment met verschillende pH-waarden:
pH 4 5 6 7 8 9 1 1
0 1
Activiteit T 6 9 9 6 T T T
(μmol/min) e . . . . e e e
meting 1 la 3 5 7 7 la la la
a 9 9 4 0 a a a
g 1 7 9 3 g g g
Activiteit T 6 9 9 6 T T T
(μmol/min) e . . . . e e e
meting 2 la 5 5 8 5 la la la
a 6 3 7 9 a a a
