Hogeschool Utrecht, 2022
Biotechnologie
Contents
Biotechnologie......................................................................................................................................... 1
1. Introductie in de biotechnologie ................................................................................................. 2
Gen isolatie ...................................................................................................................................... 3
Kloneer- en expressie vector ........................................................................................................... 3
Overzicht vectoren .......................................................................................................................... 4
Overzicht DNA transfer methoden .................................................................................................. 4
Biotechnologische domeinen .......................................................................................................... 5
Overwegingen bij de keuze van een expressiesysteem ...................................................................... 8
2. Isolatie en mutatie van een 'gene of interest'............................................................................. 9
Isolatie van een Gene of Interest (G.O.I.) ........................................................................................ 9
Mutagenese en protein engineering ............................................................................................. 16
Fusie-eiwitten en in frame klonering ............................................................................................ 21
3. Expressie door bacteriën ........................................................................................................... 24
Inleiding E.coli als expressiesysteem ................................................................................................. 24
Transformatie en selectie .................................................................................................................. 28
Integratie G.O.I. in het gastheergenoom .......................................................................................... 29
Induceerbare expressie in E.coli ........................................................................................................ 32
E.coli expressieproblemen en oplossingen ....................................................................................... 38
4. Expressie door gist..................................................................................................................... 43
Inleiding gist ...................................................................................................................................... 43
Gist vectoren en eiwitproduktie........................................................................................................ 44
Andere schimmels ............................................................................................................................. 50
5. Expressie m.b.v. baculovirus ..................................................................................................... 51
Natuurlijke cyclus baculovirus ........................................................................................................... 51
Baculovirus als expressievector......................................................................................................... 52
6. Expressie door animale cellen ................................................................................................... 57
Inleiding animale cellen ..................................................................................................................... 57
Animale vectoren (plasmiden) .......................................................................................................... 58
Transfectie, selectie en integratie ..................................................................................................... 62
Induceerbare expressie met tet-on/tet-off ....................................................................................... 68
Animale vectoren (virussen).............................................................................................................. 69
, Aangepaste cellen voor verhoogde produktie .................................................................................. 72
Voorbeelden medische toepassingen ............................................................................................... 74
7. Expressie door transgene planten ............................................................................................. 76
Introductie genetisch gemodificeerde planten ................................................................................. 76
Het maken van genetisch gemodificeerde planten .......................................................................... 78
Planten als produktiesysteem ........................................................................................................... 83
8. Genetisch gemodificeerde dieren ............................................................................................. 86
Toepassingen van genetisch gemodificeerde dieren ........................................................................ 86
Maken van een transgene muis ........................................................................................................ 89
Maken van een knock-out muis ........................................................................................................ 93
Induceerbare knock-outs met het Cre-loxP recombinatie system.................................................... 98
Genome editing met het ................................................................................................................... 99
CRISP-Cas systeem............................................................................................................................. 99
9. Gentherapie............................................................................................................................... 99
Inleiding ............................................................................................................................................. 99
Strategiëen ...................................................................................................................................... 101
Virale DNA delivery ......................................................................................................................... 109
Veiligheid virale vectoren ................................................................................................................ 116
Niet-virale DNA delivery .................................................................................................................. 117
Klinische trials .................................................................................................................................. 118
10. Proceskunde voor de biotechnologie...................................................................................... 120
Bioreactoren .................................................................................................................................... 120
Downstream processing .................................................................................................................. 126
11. Ethiek en maatschappelijke perceptie van biotechnologie .................................................... 129
Inleiding in de ethiek ....................................................................................................................... 129
Biotechnologie en maatschappelijk wantrouwen ........................................................................... 130
Ontstaan van morele kwesties ........................................................................................................ 131
1. Introductie in de biotechnologie
*Note: Bij RNA: 5’ heeft een OH groep en 3’ poly a staart*
Overwegingen bij de keuze van een expressiesysteem
Expressiesystemen
,Gen isolatie
Gen uit genoom halen met behulp van primers in de PCR
- Kan elke cel gebruiken omdat DNA wordt geïsoleerd
mRNA kan gebruikt worden om het gen te isoleren maar hiervoor zijn ook nadelen:
- Kan niet terug naar DNA
- Moet specifiek weefsel gebruiken waar het eiwit tot expressie komt
- Kan niet in een expressievector dus moet cDNA van gemaakt worden
Het voordeel:
- Geen intronen
Kloneer- en expressie vector
De kloneer en expressie vectoren bevatten de volgende componenten:
Kloneer vector Expressie vector
ORI (origin of replication) ORI (origin of replication)
Multiple cloning site (waar de meeste RE Multiple cloning site (waar de meeste RE
bevinden) bevinden)
Selectie marker (antibiotica resistentie) Promoter en terminator (followed by hairpin)
, Visual marker (GFP/RFP) *dit is optioneel, dit is
niet persee nodig*
Overzicht vectoren
plasmide bacterieel
2 µm circle
shuttle plasmide
virus faag λ
baculo
retro
vaccinia
adeno
plasmide-virus tussenvormen cosmide (plasmide met faag λ cos sites)
fosmide (plasmide met faag λ cos sites)
phagemide (co-infectie plasmide met M13 faag)
artificieel chromosoom BAC
YAC
Expressiesysteem
Expressievector met gekloneerd g.o.i.
+ → Hoe breng je deze samen?
Geschikte gastheercel
Begrippen m.b.t. DNA transfer (worden vaak door elkaar gebruikt)
Transfectie opname vreemd DNA (tijdelijk), meestal animale cel bedoeld.
Transformatie opname vreemd DNA (integratie in gastheer genoom, blijvend veranderd), zowel
animaal als prokaryoot.
Infectie DNA transfer d.m.v. virale vector.
Transductie DNA overdracht tussen prokaryoten d.m.v. een faag.
Overzicht DNA transfer methoden
Verschillende manieren worden gebruikt om DNA over te brengen naar een bepaald organisme.
E.coli wordt meestal gebruikt om het juiste gen te verkrijgen en om andere cellen te infecteren
waardoor DNA wordt overgedragen.
Biotechnologie
Contents
Biotechnologie......................................................................................................................................... 1
1. Introductie in de biotechnologie ................................................................................................. 2
Gen isolatie ...................................................................................................................................... 3
Kloneer- en expressie vector ........................................................................................................... 3
Overzicht vectoren .......................................................................................................................... 4
Overzicht DNA transfer methoden .................................................................................................. 4
Biotechnologische domeinen .......................................................................................................... 5
Overwegingen bij de keuze van een expressiesysteem ...................................................................... 8
2. Isolatie en mutatie van een 'gene of interest'............................................................................. 9
Isolatie van een Gene of Interest (G.O.I.) ........................................................................................ 9
Mutagenese en protein engineering ............................................................................................. 16
Fusie-eiwitten en in frame klonering ............................................................................................ 21
3. Expressie door bacteriën ........................................................................................................... 24
Inleiding E.coli als expressiesysteem ................................................................................................. 24
Transformatie en selectie .................................................................................................................. 28
Integratie G.O.I. in het gastheergenoom .......................................................................................... 29
Induceerbare expressie in E.coli ........................................................................................................ 32
E.coli expressieproblemen en oplossingen ....................................................................................... 38
4. Expressie door gist..................................................................................................................... 43
Inleiding gist ...................................................................................................................................... 43
Gist vectoren en eiwitproduktie........................................................................................................ 44
Andere schimmels ............................................................................................................................. 50
5. Expressie m.b.v. baculovirus ..................................................................................................... 51
Natuurlijke cyclus baculovirus ........................................................................................................... 51
Baculovirus als expressievector......................................................................................................... 52
6. Expressie door animale cellen ................................................................................................... 57
Inleiding animale cellen ..................................................................................................................... 57
Animale vectoren (plasmiden) .......................................................................................................... 58
Transfectie, selectie en integratie ..................................................................................................... 62
Induceerbare expressie met tet-on/tet-off ....................................................................................... 68
Animale vectoren (virussen).............................................................................................................. 69
, Aangepaste cellen voor verhoogde produktie .................................................................................. 72
Voorbeelden medische toepassingen ............................................................................................... 74
7. Expressie door transgene planten ............................................................................................. 76
Introductie genetisch gemodificeerde planten ................................................................................. 76
Het maken van genetisch gemodificeerde planten .......................................................................... 78
Planten als produktiesysteem ........................................................................................................... 83
8. Genetisch gemodificeerde dieren ............................................................................................. 86
Toepassingen van genetisch gemodificeerde dieren ........................................................................ 86
Maken van een transgene muis ........................................................................................................ 89
Maken van een knock-out muis ........................................................................................................ 93
Induceerbare knock-outs met het Cre-loxP recombinatie system.................................................... 98
Genome editing met het ................................................................................................................... 99
CRISP-Cas systeem............................................................................................................................. 99
9. Gentherapie............................................................................................................................... 99
Inleiding ............................................................................................................................................. 99
Strategiëen ...................................................................................................................................... 101
Virale DNA delivery ......................................................................................................................... 109
Veiligheid virale vectoren ................................................................................................................ 116
Niet-virale DNA delivery .................................................................................................................. 117
Klinische trials .................................................................................................................................. 118
10. Proceskunde voor de biotechnologie...................................................................................... 120
Bioreactoren .................................................................................................................................... 120
Downstream processing .................................................................................................................. 126
11. Ethiek en maatschappelijke perceptie van biotechnologie .................................................... 129
Inleiding in de ethiek ....................................................................................................................... 129
Biotechnologie en maatschappelijk wantrouwen ........................................................................... 130
Ontstaan van morele kwesties ........................................................................................................ 131
1. Introductie in de biotechnologie
*Note: Bij RNA: 5’ heeft een OH groep en 3’ poly a staart*
Overwegingen bij de keuze van een expressiesysteem
Expressiesystemen
,Gen isolatie
Gen uit genoom halen met behulp van primers in de PCR
- Kan elke cel gebruiken omdat DNA wordt geïsoleerd
mRNA kan gebruikt worden om het gen te isoleren maar hiervoor zijn ook nadelen:
- Kan niet terug naar DNA
- Moet specifiek weefsel gebruiken waar het eiwit tot expressie komt
- Kan niet in een expressievector dus moet cDNA van gemaakt worden
Het voordeel:
- Geen intronen
Kloneer- en expressie vector
De kloneer en expressie vectoren bevatten de volgende componenten:
Kloneer vector Expressie vector
ORI (origin of replication) ORI (origin of replication)
Multiple cloning site (waar de meeste RE Multiple cloning site (waar de meeste RE
bevinden) bevinden)
Selectie marker (antibiotica resistentie) Promoter en terminator (followed by hairpin)
, Visual marker (GFP/RFP) *dit is optioneel, dit is
niet persee nodig*
Overzicht vectoren
plasmide bacterieel
2 µm circle
shuttle plasmide
virus faag λ
baculo
retro
vaccinia
adeno
plasmide-virus tussenvormen cosmide (plasmide met faag λ cos sites)
fosmide (plasmide met faag λ cos sites)
phagemide (co-infectie plasmide met M13 faag)
artificieel chromosoom BAC
YAC
Expressiesysteem
Expressievector met gekloneerd g.o.i.
+ → Hoe breng je deze samen?
Geschikte gastheercel
Begrippen m.b.t. DNA transfer (worden vaak door elkaar gebruikt)
Transfectie opname vreemd DNA (tijdelijk), meestal animale cel bedoeld.
Transformatie opname vreemd DNA (integratie in gastheer genoom, blijvend veranderd), zowel
animaal als prokaryoot.
Infectie DNA transfer d.m.v. virale vector.
Transductie DNA overdracht tussen prokaryoten d.m.v. een faag.
Overzicht DNA transfer methoden
Verschillende manieren worden gebruikt om DNA over te brengen naar een bepaald organisme.
E.coli wordt meestal gebruikt om het juiste gen te verkrijgen en om andere cellen te infecteren
waardoor DNA wordt overgedragen.
