Moleculaire diagnostiek
**Snap de principe van een techniek voor de toets en hoe je die kan inzetten**
Les 1
- Moleculaire diagnostiek gaat over analyse van DNA/RNA moleculen. Naast
moleculaire diagnostiek zijn er ook nog andere diagnostieken.
- Directe en indirecte diagnostiek
→ Direct: direct naar het pathogeen of gen op zoek en aantonen
→ Indirect: kijken naar een reactie (ontsteking) die plaats heeft gevonden, zijn er
bepaalde antilichamen aanwezig?
Wij kijken naar directe diagnostiek
Belangrijk voor een diagnostische test:
1. Een test moet specifiek zijn voor wat je wil aantonen
2. Snelheid
3. Gevoeligheid
4. Betrouwbaarheid → interne controles zijn belangrijk, deze doorlopen het hele
proces van isolatie tot amplificatie om foute-negatieve te voorkomen
5. Kosten
DNA en RNA technieken:
- DNA isolatie
- PCR, sequencing
- Als je RNA zoekt, moet je reverse transcriptase doen om er dubbelstrengs DNA van te
maken voordat je begint met een techniek
- DNA en RNA kan geisoleerd worden uit histologische coupes, formaline preserveerd het
weefsel en cross-linken met eiwitten
- Om specifieke cellen te isoleren kan er gebruik gemaakt worden van laser
microdissectie
, Stap 1: sample komt binnen op het lab, kan biopt zijn, vloeibaar bloed, cytologische
punctie, kweek, infectie enz. het sample moet vloeibaar zijn/gemaakt worden.
- Het biopt moet fijngemalen worden zodat de cellen gelyseerd zijn. Dan binden
aan beads en dan wassen van de beads om viezigheden te verwijderen en
elueren zodat het eraf gehaald kan worden.
- Met magneet magnetic beads vasthouden en wassen. Dan elutiebuffer en dan
heb je je gezuiverde nucleïnezuren.
Verschillende stations om je samples in te doen:
- Zo’n apparaat is alleen efficiënt als je ook veel samples hebt. Niet voor 1 of 2
samples per dag, dan kun je het beter met de hand doen. Maar in het ziekenhuis
is het opgeschaald en komen veel samples waardoor het automatisch gebeurd..
Stap 2: Volgende stap is analyse
- Spectrofotometer: zuiverheid
- Gel elektroforese: grootte
- PCR, sequencing: volgorde
→ Hoe weet ik nou dat het niet mis is gegaan. Hoe weet je zeker dat de uitkomst
negatief is en niet dat de isolatie mislukt is?
- Je kan elke negatief opnieuw doen, maar toch weet je het dan niet zeker.
- Je moet een controle inbouwen. Interne ingebouwde controle. Je voegt een
beetje DNA toe van wat niet te maken heeft met je sample in een bekende
hoeveelheid. Als je je interne controle DNA kan terugvinden en je sample is
negatief, dan weet je dat de isolatie goed is gegaan.
**Snap de principe van een techniek voor de toets en hoe je die kan inzetten**
Les 1
- Moleculaire diagnostiek gaat over analyse van DNA/RNA moleculen. Naast
moleculaire diagnostiek zijn er ook nog andere diagnostieken.
- Directe en indirecte diagnostiek
→ Direct: direct naar het pathogeen of gen op zoek en aantonen
→ Indirect: kijken naar een reactie (ontsteking) die plaats heeft gevonden, zijn er
bepaalde antilichamen aanwezig?
Wij kijken naar directe diagnostiek
Belangrijk voor een diagnostische test:
1. Een test moet specifiek zijn voor wat je wil aantonen
2. Snelheid
3. Gevoeligheid
4. Betrouwbaarheid → interne controles zijn belangrijk, deze doorlopen het hele
proces van isolatie tot amplificatie om foute-negatieve te voorkomen
5. Kosten
DNA en RNA technieken:
- DNA isolatie
- PCR, sequencing
- Als je RNA zoekt, moet je reverse transcriptase doen om er dubbelstrengs DNA van te
maken voordat je begint met een techniek
- DNA en RNA kan geisoleerd worden uit histologische coupes, formaline preserveerd het
weefsel en cross-linken met eiwitten
- Om specifieke cellen te isoleren kan er gebruik gemaakt worden van laser
microdissectie
, Stap 1: sample komt binnen op het lab, kan biopt zijn, vloeibaar bloed, cytologische
punctie, kweek, infectie enz. het sample moet vloeibaar zijn/gemaakt worden.
- Het biopt moet fijngemalen worden zodat de cellen gelyseerd zijn. Dan binden
aan beads en dan wassen van de beads om viezigheden te verwijderen en
elueren zodat het eraf gehaald kan worden.
- Met magneet magnetic beads vasthouden en wassen. Dan elutiebuffer en dan
heb je je gezuiverde nucleïnezuren.
Verschillende stations om je samples in te doen:
- Zo’n apparaat is alleen efficiënt als je ook veel samples hebt. Niet voor 1 of 2
samples per dag, dan kun je het beter met de hand doen. Maar in het ziekenhuis
is het opgeschaald en komen veel samples waardoor het automatisch gebeurd..
Stap 2: Volgende stap is analyse
- Spectrofotometer: zuiverheid
- Gel elektroforese: grootte
- PCR, sequencing: volgorde
→ Hoe weet ik nou dat het niet mis is gegaan. Hoe weet je zeker dat de uitkomst
negatief is en niet dat de isolatie mislukt is?
- Je kan elke negatief opnieuw doen, maar toch weet je het dan niet zeker.
- Je moet een controle inbouwen. Interne ingebouwde controle. Je voegt een
beetje DNA toe van wat niet te maken heeft met je sample in een bekende
hoeveelheid. Als je je interne controle DNA kan terugvinden en je sample is
negatief, dan weet je dat de isolatie goed is gegaan.
