Moleculaire en Biochemische technieken COURSE 5BM
(Praktijktechnieken)
Les 1:
Deze besproken technieken kunnen in de kennistoets zitten
RNA is omgezet in cDNA, dit codeert voor het eiwit. Hiermee gaan we in de praktijk aan de slag.
Hier zit een eiwit in (IDH) om te onderzoeken.
… De restrictiesites worden aan ons IDH vastgezet, dit wordt door PCR gedaan. De eindjes passen nu
op de vector, dit wordt geligeerd en de bacterie wordt getransformeerd. De bacterie gaat dit continu
aanmaken.
PCR: wordt gebruikt om meerdere kopien te maken van een gen. Dit heet kloneren. Je begint met
een eppje met componenten erin. Vervolgens wordt door denaturatie de strengen uit elkaar
gehaald. Dit wordt gedaan voor de binding van de primers. Vervolgens wordt door annaeling stap
uitvgevorerd. Hierdoor binden de primers, en hierdoor kan polymerase kan binden. Door de binding
van polymerase worden de strengen verlengd. Daarna komt elongatie. Hierdoor lopen de primers.
Dit wordt continu herhaald.
PCR bestaat uit 3 stappen:
Wat doe je? Tijd Temperatuur
Start denaturatie van template DNA 4-5 min. +-95 °C
Denaturatie (strengen uit elkaar) 30-60 sec. +-95 °C
Annealing (primers er op zetten) 30 sec. 55-65 °C of bijv. 50-60 °C
Elongatie (primers laten lopen) 41,28 sec 42 sec +-72 °C
Extra elongatietijd om alle PCR 5 min. +-72 °C
fragmenten af te maken
Hold 4 °C
Alle temperaturen en tijd zijn afhankelijk van het protocol, echter zijn dit de meest
voorkomende temperaturen en tijd.
Annealing temperatuur gebeurd tussen de smelttemperaturen van de forward en reversed
primer. Met een te hoge temp kan niet binden bij annealing temp, maar te laag zorgt ervoor
aspecifieke bindingen. Als deze temperatuur voor 1 primer goed is maar de ander niet krijg je
afwijkende stukken.
, Dit kan worden berekend door voor elke A-T nucleotide 2 graden te pakken en elk G-C
nucleotide 4 graden. Dit verschil heeft te maken met verschil in H-bruggen. De
temperatuur van annealing moet tussen de forward en reversed primer inliggen -5
graden. Dus stel de forward is 62 graden en reversed 60, dan ligt de annealing
temperatuur tussen (62-5=) 57 en (60-5=) 55 graden celsius. Hiervoor wordt altijd de
laagste temp. gepakt.
De elongatietijd bereken gaat als volgt: TAQ-polymerase heeft een snelheid van 1KB/minuut.
Dit is gelijk aan 1000 bp/minuut, dus 0,06 seconde per basepaar. Stel je hebt een PCR lengte
van 688 bp, dan is het 688 * 0,06 = 41,28 seconde.
Of bijv. 2.3 KB lang, dan is dit 2,18 min.
- Maak hier ietsje langer van, dus bijv. 2,3 min. Dat is beter.
Hold: DNA polymerase inactief maken, dit gebeurd onder 14 graden ongeveer. Hierdoor blijft
DNA stabiel
Waarom maak je een mastermix? Je maakt een mastermix voor 12 PCR cycles. Er vinden er
maar 10 plaats, maar voor het geval dat er iets mis gaat heb je extra. Alle omstandigheden in
de mastermix moeten exact hetzelfde zijn.
Functie van alle stoffen in mastermix:
- Primers (specifiek stukje DNA amplificeren)
- dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP: losse nucleotiden)
- DNA Polymerase (nucleotide inbouwen)
- DNA template (om te vermeerderen)
- Millli Q
- Buffer (zout, pH stabilisatie= condities voor enzym polymerase goed houden)
- MgCl2 (cofactor DNA polymerase)
Te veel DNA kan ervoor zorgen dat de PCR reactie geinhibeerd wordt (primers snel op, reactie
verloopt niet goed)
Soorten DNA polymerase:
Dus TAQ polymerase is erg accuraat, maar
er kunnen foutjes plaatsvinden want laat
geen proofreading plaatsvinden.
PFU DNA polymerase kan wel
proofreading laten plaatsvinden.
‘5 kant is …, ‘3 kant is …
De complementaire streng is altijd andersom. Als je 1 streng ziet is het
nog steeds DNA, dus is het altijd de bovenste. Deze loopt van ‘5 naar
‘3. DNA word dus altijd van ‘5 ‘3 geschreven. Aan de kant van ‘3
worden nieuwe nucleotiden toegevoegd
De forward primer (blauw) bindt aan de 3’ kant van de onderste streng.
Dit wordt naar ‘5 gemaakt (complementaire streng). Vervolgens zal de
DNA polymerase van ‘3 naar ‘5 lopen. Voor reverse primer is dit andersom (rood)
Je forward primer heeft dezelfde sequentie als de bovenste streng. Deze wordt altijd gegeven dus dat
is lekker makkelijk. De reverse primer is dus automatisch de onderste, dit is tegenovergestelde
nucleotiden van bovenste.
(Praktijktechnieken)
Les 1:
Deze besproken technieken kunnen in de kennistoets zitten
RNA is omgezet in cDNA, dit codeert voor het eiwit. Hiermee gaan we in de praktijk aan de slag.
Hier zit een eiwit in (IDH) om te onderzoeken.
… De restrictiesites worden aan ons IDH vastgezet, dit wordt door PCR gedaan. De eindjes passen nu
op de vector, dit wordt geligeerd en de bacterie wordt getransformeerd. De bacterie gaat dit continu
aanmaken.
PCR: wordt gebruikt om meerdere kopien te maken van een gen. Dit heet kloneren. Je begint met
een eppje met componenten erin. Vervolgens wordt door denaturatie de strengen uit elkaar
gehaald. Dit wordt gedaan voor de binding van de primers. Vervolgens wordt door annaeling stap
uitvgevorerd. Hierdoor binden de primers, en hierdoor kan polymerase kan binden. Door de binding
van polymerase worden de strengen verlengd. Daarna komt elongatie. Hierdoor lopen de primers.
Dit wordt continu herhaald.
PCR bestaat uit 3 stappen:
Wat doe je? Tijd Temperatuur
Start denaturatie van template DNA 4-5 min. +-95 °C
Denaturatie (strengen uit elkaar) 30-60 sec. +-95 °C
Annealing (primers er op zetten) 30 sec. 55-65 °C of bijv. 50-60 °C
Elongatie (primers laten lopen) 41,28 sec 42 sec +-72 °C
Extra elongatietijd om alle PCR 5 min. +-72 °C
fragmenten af te maken
Hold 4 °C
Alle temperaturen en tijd zijn afhankelijk van het protocol, echter zijn dit de meest
voorkomende temperaturen en tijd.
Annealing temperatuur gebeurd tussen de smelttemperaturen van de forward en reversed
primer. Met een te hoge temp kan niet binden bij annealing temp, maar te laag zorgt ervoor
aspecifieke bindingen. Als deze temperatuur voor 1 primer goed is maar de ander niet krijg je
afwijkende stukken.
, Dit kan worden berekend door voor elke A-T nucleotide 2 graden te pakken en elk G-C
nucleotide 4 graden. Dit verschil heeft te maken met verschil in H-bruggen. De
temperatuur van annealing moet tussen de forward en reversed primer inliggen -5
graden. Dus stel de forward is 62 graden en reversed 60, dan ligt de annealing
temperatuur tussen (62-5=) 57 en (60-5=) 55 graden celsius. Hiervoor wordt altijd de
laagste temp. gepakt.
De elongatietijd bereken gaat als volgt: TAQ-polymerase heeft een snelheid van 1KB/minuut.
Dit is gelijk aan 1000 bp/minuut, dus 0,06 seconde per basepaar. Stel je hebt een PCR lengte
van 688 bp, dan is het 688 * 0,06 = 41,28 seconde.
Of bijv. 2.3 KB lang, dan is dit 2,18 min.
- Maak hier ietsje langer van, dus bijv. 2,3 min. Dat is beter.
Hold: DNA polymerase inactief maken, dit gebeurd onder 14 graden ongeveer. Hierdoor blijft
DNA stabiel
Waarom maak je een mastermix? Je maakt een mastermix voor 12 PCR cycles. Er vinden er
maar 10 plaats, maar voor het geval dat er iets mis gaat heb je extra. Alle omstandigheden in
de mastermix moeten exact hetzelfde zijn.
Functie van alle stoffen in mastermix:
- Primers (specifiek stukje DNA amplificeren)
- dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP: losse nucleotiden)
- DNA Polymerase (nucleotide inbouwen)
- DNA template (om te vermeerderen)
- Millli Q
- Buffer (zout, pH stabilisatie= condities voor enzym polymerase goed houden)
- MgCl2 (cofactor DNA polymerase)
Te veel DNA kan ervoor zorgen dat de PCR reactie geinhibeerd wordt (primers snel op, reactie
verloopt niet goed)
Soorten DNA polymerase:
Dus TAQ polymerase is erg accuraat, maar
er kunnen foutjes plaatsvinden want laat
geen proofreading plaatsvinden.
PFU DNA polymerase kan wel
proofreading laten plaatsvinden.
‘5 kant is …, ‘3 kant is …
De complementaire streng is altijd andersom. Als je 1 streng ziet is het
nog steeds DNA, dus is het altijd de bovenste. Deze loopt van ‘5 naar
‘3. DNA word dus altijd van ‘5 ‘3 geschreven. Aan de kant van ‘3
worden nieuwe nucleotiden toegevoegd
De forward primer (blauw) bindt aan de 3’ kant van de onderste streng.
Dit wordt naar ‘5 gemaakt (complementaire streng). Vervolgens zal de
DNA polymerase van ‘3 naar ‘5 lopen. Voor reverse primer is dit andersom (rood)
Je forward primer heeft dezelfde sequentie als de bovenste streng. Deze wordt altijd gegeven dus dat
is lekker makkelijk. De reverse primer is dus automatisch de onderste, dit is tegenovergestelde
nucleotiden van bovenste.
