2019-2020
Samenvatting
genoom
Week 7 t/m week 9
Door Nicole (studente BMW)
,Inhoudsopgave
Algemeen...............................................................................................................................................1
Week 7 - DNA en RNA technieken..........................................................................................................4
DNA technieken..................................................................................................................................4
Poly Chain Reaction (PCR)...............................................................................................................4
Restrictie-enzymen.........................................................................................................................7
Gel-elektroforese............................................................................................................................8
Sanger sequencing (dideoxy sequencing).....................................................................................10
RNA technieken................................................................................................................................12
In-situ hybridisatie........................................................................................................................12
Kwantitatieve RT-PCR...................................................................................................................12
RNA sequencing (RNA-seq)...........................................................................................................12
Recombinant DNA technieken..........................................................................................................14
DNA-klonering..............................................................................................................................14
Reporter-genen............................................................................................................................18
RNA-interferentie.........................................................................................................................19
CRISPR/Cas9 gene editing.............................................................................................................20
Week 8 - Eiwittechnieken en CRISPR/Cas9...........................................................................................24
Eiwit-analyse technieken..................................................................................................................24
SDS-PAGE (SDS polyacrylamide-gel electrophoresis)....................................................................24
Western Blotting...........................................................................................................................25
Fusie-eiwitten...............................................................................................................................26
Co-IP (Co-immunoprecipitation) & ChIP (Chromatine immunoprecipitation)..............................26
Enzymactiviteit assays (m.b.v. spectrofotometer)........................................................................28
Week 9 - Next Generation Sequencing.................................................................................................29
Referentiegenoom............................................................................................................................30
Illumina sequencing..........................................................................................................................30
DNase-seq.....................................................................................................................................33
MNase-seq....................................................................................................................................33
ChIP-seq........................................................................................................................................34
RNA-seq........................................................................................................................................34
Algemeen
Er zijn verschillende technieken waarmee DNA, RNA, eiwitten en processen bestudeerd kunnen
worden. Dit kan op twee manieren:
1
, In vivo DNA, RNA, eiwit of proces bestuderen in de cel (dus in de ‘levende’ omgeving).
In vitro DNA, RNA, eiwit of proces bestuderen in een reageerbuis.
Het basisprincipe in veel DNA technieken en RNA technieken is hybridisatie. Dit houdt in dat twee
complementaire strengen uit zichzelf zullen basenparen, omdat dit energiegunstig is. Basenparing
van twee strengen houdt stand tot ongeveer 50°C.
Onder
normale
omstandigheden worden de twee strengen van de dubbele DNA helix bij elkaar gehouden door
waterstofbruggen. Deze relatief zwakke, niet-covalente bindingen kunnen echter gemakkelijk
verbroken worden. Dit wordt denaturatie genoemd en hierbij laten de twee strengen van elkaar los.
De covalente bindingen tussen de nucleotiden op dezelfde streng blijven hierbij wel behouden. De
makkelijkste manier om DNA denaturatie te bereiken is door het DNA te verhitten tot ongeveer
90°C.
Probes zijn kleine stukjes DNA of RNA van ongeveer 30 nucleotiden lang en worden meestal door
commerciële bedrijven geproduceerd en verkocht aan onderzoekers. Probes zijn vaak fluorescent
gelabeld en zijn zeer handig bij DNA en RNA technieken, doordat je een specifieke sequentie kunt
nemen, die bijvoorbeeld moet basenparen met een complementaire sequentie. De kans dat er een
willekeurig stuk DNA aan deze probe zal hybridiseren is zeer onwaarschijnlijk, hierdoor zal de probe
zeer specifiek aan het DNA binden. Het kan natuurlijk per toeval voorkomen dat het DNA deze
sequentie, die complementair is aan de probe, meerdere keren bevat. Dit kan vooraf gecheckt
worden door het genoom te scannen in silico (met gebruik van een computer).
Overzicht van alle technieken
DNA technieken:
2
, 1. PCR
2. Restrictie-enzymen
3. DNA-gelelektroforese
4. Sanger sequencing (dideoxy-sequencing)
5. Next Generation Sequencing (week 9)
RNA technieken:
1. (In-situ) hybridisatie
2. cDNA maken
3. Kwantitatieve RT-PCR
4. RNA-seq (RNA sequencing)
DNA manipulatie technieken (recombinant DNA-technologie):
1. PCR
2. Restrictie-enzymen
3. DNA-klonering
4. Plaatsgerichte mutagenese
5. Genomische banken en cDNA banken
6. (Over)expressie
7. Fusie-eiwitten en reporter-genen
8. RNA-interferentie d.m.v. shRNA’s
9. CRISPR/Cas9 gene editing
Eiwit-analyse technieken (week 8):
1. SDS-PAGE (SDS-Poly Acrylamide Gel-Electroforese)
2. Western Blotting
3. Fusie-eiwitten
4. Co-IP en ChIP
5. Enzymactiviteit assays (m.b.v. spectrofotometer)
Overzicht doel van de technieken
DNA-analyse technieken:
Aanwezigheid
Sequentie
Positie
(m)RNA-analyse technieken:
Aanwezigheid
Sequentie
Positie
Eiwit-analyse technieken:
Aanwezigheid
Lokalisatie
Sequentie
Activiteit
3
,Week 7 - DNA en RNA technieken
DNA technieken
Poly Chain Reaction (PCR)
PCR heeft twee doelen:
Amplificeren
Selecteren
Daarnaast heeft het twee voorwaarden:
De sequentie van de uiteinden van het stuk DNA dat je wilt vermeerderen moet bekend zijn,
zodat je de juiste primers kan toevoegen.
Het stuk DNA dat je wilt vermeerderen is maximaal enkele duizenden basenparen lang.
Genen kloneren in vitro
Het succes van PCR hangt af van de selectiviteit van DNA-hybridisatie en het vermogen van DNA-
polymerase om het DNA te repliceren in vitro. DNA-polymerase heeft een primer nodig om de
replicatie te kunnen starten, deze primers worden afgestemd op de sequentie die vermeerderd moet
worden.
Elke PCR-cyclus omvat drie stappen:
1. Het dubbelstrengs DNA wordt kort verhit om de twee strengen uit elkaar te halen.
2. Het DNA wordt blootgesteld aan een grote overmaat van een twee specifieke primers, die
ontworpen zijn om het te amplificeren gebied te ondersteunen. Daarnaast wordt het
monster gekoeld om de primers te laten hybridiseren met de complementaire sequenties in
de twee DNA strengen.
3. Dit mengsel wordt geïncubeerd met DNA-polymerase en de vier verschillende dNTP’s, zodat
het DNA kan worden gesynthetiseerd vanaf de primers.
Om het DNA te amplificeren, wordt deze cyclus vele malen herhaald door het monster steeds
opnieuw te verwarmen, om de nieuw gesynthetiseerde DNA strengen weer van elkaar te scheiden.
De techniek hangt af van het gebruik van een speciale DNA-polymerase, die geïsoleerd is uit een
thermofiele bacterie. Dit DNA-polymerase is namelijk stabiel bij veel hogere temperaturen dan
eukaryote DNA-polymerasen, waardoor het dus niet zal denatureren bij de warmtebehandeling in
stap 1.
In
Figuur 1 Twee (gepaarde) primers sturen de synthese aan van een gewenst DNA segment in een reageerbuis.
de cycli die volgen op de eerst cyclus, dienen alle nieuwe gesynthetiseerde DNA-moleculen als
template voor de volgende replicatieronde (Figuur 2). Elke cyclus duurt ongeveer vijf minuten.
4
, Figuur 2 PCR herhaalt de cycli in figuur 1 meerdere keren en gebruikt het nieuw gesynthetiseerde DNA ook als
template.
Bij PCR wordt er gebruik gemaakt van een thermocyclus waarin drie fasen te onderscheiden zijn:
Denaturatie Hierbij wordt er gedurende 20 tot 30 seconden verhit tot 95°C.
Annealing Hierbij wordt er gedurende 20 tot 40 seconden verhit tot 50-60°C.
Elongatie Hierbij wordt er verhit tot 72°C.
De denaturatie vindt plaats bij een temperatuur boven de smelttemperatuur (T m) van DNA. De Tm van
DNA is de temperatuur waarbij de helft van het DNA zich in een dubbele helix bevindt en de andere
helft zich als enkele streng in de cellen bevindt.
Tijdens de annealing binden de primers aan de complementaire stukken DNA. De temperatuur
waarbij de annealing plaatsvindt, is afhankelijk van de lengte van de primers. Dit is gewoonlijk 3°C tot
5°C lager dan de lage Tm van de primer. Het vindt plaats tussen de 50°C en 65°C.
Forward primer Bindt aan de antisense streng.
Reverse primer Bindt aan de sense streng.
De elongatie vindt plaats bij een temperatuur van 72°C, omdat bij deze temperatuur de activiteit van
DNA-polymerase optimaal is. Het kan dan per minuut 1000 basenparen inbouwen.
Om een PCR uit te voeren zijn er een aantal componenten nodig:
DNA-template
Primers (moeten aan een aantal eisen voldoen)
Zijn 15 tot 30 nucleotiden lang.
Bestaan voor 50% uit guanine en cytosine.
Tm boven 50°C en binnen 1-2°C van elkaar.
Niet complementair zijn aan elkaar.
Mogen geen secundaire structuur bevatten (zoals bv. hairpinloop).
DNA-polymerase (afkomstig van bacteriën, waardoor ze temperaturen boven de 90°C
kunnen weerstaan en niet denatureren)
dNTP’s
Bufferoplossing met belangrijke ionen (om de pH te controleren)
5
Samenvatting
genoom
Week 7 t/m week 9
Door Nicole (studente BMW)
,Inhoudsopgave
Algemeen...............................................................................................................................................1
Week 7 - DNA en RNA technieken..........................................................................................................4
DNA technieken..................................................................................................................................4
Poly Chain Reaction (PCR)...............................................................................................................4
Restrictie-enzymen.........................................................................................................................7
Gel-elektroforese............................................................................................................................8
Sanger sequencing (dideoxy sequencing).....................................................................................10
RNA technieken................................................................................................................................12
In-situ hybridisatie........................................................................................................................12
Kwantitatieve RT-PCR...................................................................................................................12
RNA sequencing (RNA-seq)...........................................................................................................12
Recombinant DNA technieken..........................................................................................................14
DNA-klonering..............................................................................................................................14
Reporter-genen............................................................................................................................18
RNA-interferentie.........................................................................................................................19
CRISPR/Cas9 gene editing.............................................................................................................20
Week 8 - Eiwittechnieken en CRISPR/Cas9...........................................................................................24
Eiwit-analyse technieken..................................................................................................................24
SDS-PAGE (SDS polyacrylamide-gel electrophoresis)....................................................................24
Western Blotting...........................................................................................................................25
Fusie-eiwitten...............................................................................................................................26
Co-IP (Co-immunoprecipitation) & ChIP (Chromatine immunoprecipitation)..............................26
Enzymactiviteit assays (m.b.v. spectrofotometer)........................................................................28
Week 9 - Next Generation Sequencing.................................................................................................29
Referentiegenoom............................................................................................................................30
Illumina sequencing..........................................................................................................................30
DNase-seq.....................................................................................................................................33
MNase-seq....................................................................................................................................33
ChIP-seq........................................................................................................................................34
RNA-seq........................................................................................................................................34
Algemeen
Er zijn verschillende technieken waarmee DNA, RNA, eiwitten en processen bestudeerd kunnen
worden. Dit kan op twee manieren:
1
, In vivo DNA, RNA, eiwit of proces bestuderen in de cel (dus in de ‘levende’ omgeving).
In vitro DNA, RNA, eiwit of proces bestuderen in een reageerbuis.
Het basisprincipe in veel DNA technieken en RNA technieken is hybridisatie. Dit houdt in dat twee
complementaire strengen uit zichzelf zullen basenparen, omdat dit energiegunstig is. Basenparing
van twee strengen houdt stand tot ongeveer 50°C.
Onder
normale
omstandigheden worden de twee strengen van de dubbele DNA helix bij elkaar gehouden door
waterstofbruggen. Deze relatief zwakke, niet-covalente bindingen kunnen echter gemakkelijk
verbroken worden. Dit wordt denaturatie genoemd en hierbij laten de twee strengen van elkaar los.
De covalente bindingen tussen de nucleotiden op dezelfde streng blijven hierbij wel behouden. De
makkelijkste manier om DNA denaturatie te bereiken is door het DNA te verhitten tot ongeveer
90°C.
Probes zijn kleine stukjes DNA of RNA van ongeveer 30 nucleotiden lang en worden meestal door
commerciële bedrijven geproduceerd en verkocht aan onderzoekers. Probes zijn vaak fluorescent
gelabeld en zijn zeer handig bij DNA en RNA technieken, doordat je een specifieke sequentie kunt
nemen, die bijvoorbeeld moet basenparen met een complementaire sequentie. De kans dat er een
willekeurig stuk DNA aan deze probe zal hybridiseren is zeer onwaarschijnlijk, hierdoor zal de probe
zeer specifiek aan het DNA binden. Het kan natuurlijk per toeval voorkomen dat het DNA deze
sequentie, die complementair is aan de probe, meerdere keren bevat. Dit kan vooraf gecheckt
worden door het genoom te scannen in silico (met gebruik van een computer).
Overzicht van alle technieken
DNA technieken:
2
, 1. PCR
2. Restrictie-enzymen
3. DNA-gelelektroforese
4. Sanger sequencing (dideoxy-sequencing)
5. Next Generation Sequencing (week 9)
RNA technieken:
1. (In-situ) hybridisatie
2. cDNA maken
3. Kwantitatieve RT-PCR
4. RNA-seq (RNA sequencing)
DNA manipulatie technieken (recombinant DNA-technologie):
1. PCR
2. Restrictie-enzymen
3. DNA-klonering
4. Plaatsgerichte mutagenese
5. Genomische banken en cDNA banken
6. (Over)expressie
7. Fusie-eiwitten en reporter-genen
8. RNA-interferentie d.m.v. shRNA’s
9. CRISPR/Cas9 gene editing
Eiwit-analyse technieken (week 8):
1. SDS-PAGE (SDS-Poly Acrylamide Gel-Electroforese)
2. Western Blotting
3. Fusie-eiwitten
4. Co-IP en ChIP
5. Enzymactiviteit assays (m.b.v. spectrofotometer)
Overzicht doel van de technieken
DNA-analyse technieken:
Aanwezigheid
Sequentie
Positie
(m)RNA-analyse technieken:
Aanwezigheid
Sequentie
Positie
Eiwit-analyse technieken:
Aanwezigheid
Lokalisatie
Sequentie
Activiteit
3
,Week 7 - DNA en RNA technieken
DNA technieken
Poly Chain Reaction (PCR)
PCR heeft twee doelen:
Amplificeren
Selecteren
Daarnaast heeft het twee voorwaarden:
De sequentie van de uiteinden van het stuk DNA dat je wilt vermeerderen moet bekend zijn,
zodat je de juiste primers kan toevoegen.
Het stuk DNA dat je wilt vermeerderen is maximaal enkele duizenden basenparen lang.
Genen kloneren in vitro
Het succes van PCR hangt af van de selectiviteit van DNA-hybridisatie en het vermogen van DNA-
polymerase om het DNA te repliceren in vitro. DNA-polymerase heeft een primer nodig om de
replicatie te kunnen starten, deze primers worden afgestemd op de sequentie die vermeerderd moet
worden.
Elke PCR-cyclus omvat drie stappen:
1. Het dubbelstrengs DNA wordt kort verhit om de twee strengen uit elkaar te halen.
2. Het DNA wordt blootgesteld aan een grote overmaat van een twee specifieke primers, die
ontworpen zijn om het te amplificeren gebied te ondersteunen. Daarnaast wordt het
monster gekoeld om de primers te laten hybridiseren met de complementaire sequenties in
de twee DNA strengen.
3. Dit mengsel wordt geïncubeerd met DNA-polymerase en de vier verschillende dNTP’s, zodat
het DNA kan worden gesynthetiseerd vanaf de primers.
Om het DNA te amplificeren, wordt deze cyclus vele malen herhaald door het monster steeds
opnieuw te verwarmen, om de nieuw gesynthetiseerde DNA strengen weer van elkaar te scheiden.
De techniek hangt af van het gebruik van een speciale DNA-polymerase, die geïsoleerd is uit een
thermofiele bacterie. Dit DNA-polymerase is namelijk stabiel bij veel hogere temperaturen dan
eukaryote DNA-polymerasen, waardoor het dus niet zal denatureren bij de warmtebehandeling in
stap 1.
In
Figuur 1 Twee (gepaarde) primers sturen de synthese aan van een gewenst DNA segment in een reageerbuis.
de cycli die volgen op de eerst cyclus, dienen alle nieuwe gesynthetiseerde DNA-moleculen als
template voor de volgende replicatieronde (Figuur 2). Elke cyclus duurt ongeveer vijf minuten.
4
, Figuur 2 PCR herhaalt de cycli in figuur 1 meerdere keren en gebruikt het nieuw gesynthetiseerde DNA ook als
template.
Bij PCR wordt er gebruik gemaakt van een thermocyclus waarin drie fasen te onderscheiden zijn:
Denaturatie Hierbij wordt er gedurende 20 tot 30 seconden verhit tot 95°C.
Annealing Hierbij wordt er gedurende 20 tot 40 seconden verhit tot 50-60°C.
Elongatie Hierbij wordt er verhit tot 72°C.
De denaturatie vindt plaats bij een temperatuur boven de smelttemperatuur (T m) van DNA. De Tm van
DNA is de temperatuur waarbij de helft van het DNA zich in een dubbele helix bevindt en de andere
helft zich als enkele streng in de cellen bevindt.
Tijdens de annealing binden de primers aan de complementaire stukken DNA. De temperatuur
waarbij de annealing plaatsvindt, is afhankelijk van de lengte van de primers. Dit is gewoonlijk 3°C tot
5°C lager dan de lage Tm van de primer. Het vindt plaats tussen de 50°C en 65°C.
Forward primer Bindt aan de antisense streng.
Reverse primer Bindt aan de sense streng.
De elongatie vindt plaats bij een temperatuur van 72°C, omdat bij deze temperatuur de activiteit van
DNA-polymerase optimaal is. Het kan dan per minuut 1000 basenparen inbouwen.
Om een PCR uit te voeren zijn er een aantal componenten nodig:
DNA-template
Primers (moeten aan een aantal eisen voldoen)
Zijn 15 tot 30 nucleotiden lang.
Bestaan voor 50% uit guanine en cytosine.
Tm boven 50°C en binnen 1-2°C van elkaar.
Niet complementair zijn aan elkaar.
Mogen geen secundaire structuur bevatten (zoals bv. hairpinloop).
DNA-polymerase (afkomstig van bacteriën, waardoor ze temperaturen boven de 90°C
kunnen weerstaan en niet denatureren)
dNTP’s
Bufferoplossing met belangrijke ionen (om de pH te controleren)
5
