22-10-
2021
FLUORESCENT
PROTEIN
DE VASTSTELLING VAN HET TYPE VAN EEN ONBEKEND
FLUORESCEREND EIWIT OP DNA-NIVEAU EN
EIWITNIVEAU
KIKI KROEZE EN BENTE VAN DER VELDEN
BOUWSTENEN VAN HET LEVEN
GEZONDHEID & LEVEN
AANTAL WOORDEN: 3997
, Abstract
Achtergrond
Het inbrengen van een gen dat codeert voor een gemanipuleerd fluorescent eiwit in levende cellen is
tegenwoordig een zeer bekende en gangbare onderzoekspraktijk voor biologen om de locatie en
dynamiek van verscheidene cellen te visualiseren. Het Green Fluorescent Protein (GFP) was het
eerste ontdekte eiwit met de unieke fluorescente eigenschap, maar hedendaagse kennis leert ons
dat dit eiwit verschillende mutanten heeft die andere kleuren uitzenden: Cyan Fluorescent Protein
(CFP), Yellow Fluorescent Protein (YFP) en Cherry Fluorescent Protein (CherryFP). In het practicum
zijn vier verschillende bacteriestammen uitgedeeld. Elke bacteriestam bevat een ander plasmide,
met elk een ander gen voor een fluorescerend eiwit. Het doel van het practicum is het bepalen van
het type fluorescente eiwit. Dit wordt gedaan op DNA-niveau en op eiwitniveau.
Methode
Om het experiment goed uit te kunnen voeren, werd het uitgedeelde plasmide eerst vermeerderd.
Onder DNA-niveau valt de techniek agarose-gelelektroforese, waarbij DNA-moleculen van een eiwit
worden gescheiden op grootte. De resultaten hiervan zijn vergeleken met theoretische
fragmentlengtes afkomstig van het programma ApE. Het eiwitniveau bestaat uit SDS-PAGE (zichtbaar
maken van de eiwitten), de Bradford-methode (bepalen van de eiwitconcentratie) en de absorptie-
en fluorescentiemeting (bepaling van de aangeslagen toestand en de uitzending van licht van het
eiwit). Aan de hand van de gebruikte technieken kon een conclusie worden getrokken.
Resultaten
Uit de DNA-analyse kwam als resultaat dat de fragmentlengtes achtereenvolgend 1500, 2000 en
3000 KDa zijn. Aan de hand van deze resultaten is de Rf-waarde van de marker bepaald, waarna ook
de Rf-waarde van het onbekende eiwit bepaald kon worden. Dit kwam uit op 0,51, met een daarbij
horend molecuulgewicht van 33,9 KDa. Door middel van de Bradford-methode is vastgesteld dat de
concentratie van het eiwit 243,6 µg/mL is. Na Absorptiebepaling en fluorescentiebepaling van het
eiwit, bleek de absorptie te komen op 475 en 505 nm.
Conclusie
Na uitvoering van de technieken op DNA-niveau en eiwitniveau, konden meerdere berekeningen
gedaan worden. Na vergelijking van deze uitkomsten met theoretische eigenschappen van de vier
fluorescerende eiwitten, bleek het onbekende eiwit de meeste overeenkomsten te treffen met het
Cyaan Fluorescent Protein (CFP).
1
2021
FLUORESCENT
PROTEIN
DE VASTSTELLING VAN HET TYPE VAN EEN ONBEKEND
FLUORESCEREND EIWIT OP DNA-NIVEAU EN
EIWITNIVEAU
KIKI KROEZE EN BENTE VAN DER VELDEN
BOUWSTENEN VAN HET LEVEN
GEZONDHEID & LEVEN
AANTAL WOORDEN: 3997
, Abstract
Achtergrond
Het inbrengen van een gen dat codeert voor een gemanipuleerd fluorescent eiwit in levende cellen is
tegenwoordig een zeer bekende en gangbare onderzoekspraktijk voor biologen om de locatie en
dynamiek van verscheidene cellen te visualiseren. Het Green Fluorescent Protein (GFP) was het
eerste ontdekte eiwit met de unieke fluorescente eigenschap, maar hedendaagse kennis leert ons
dat dit eiwit verschillende mutanten heeft die andere kleuren uitzenden: Cyan Fluorescent Protein
(CFP), Yellow Fluorescent Protein (YFP) en Cherry Fluorescent Protein (CherryFP). In het practicum
zijn vier verschillende bacteriestammen uitgedeeld. Elke bacteriestam bevat een ander plasmide,
met elk een ander gen voor een fluorescerend eiwit. Het doel van het practicum is het bepalen van
het type fluorescente eiwit. Dit wordt gedaan op DNA-niveau en op eiwitniveau.
Methode
Om het experiment goed uit te kunnen voeren, werd het uitgedeelde plasmide eerst vermeerderd.
Onder DNA-niveau valt de techniek agarose-gelelektroforese, waarbij DNA-moleculen van een eiwit
worden gescheiden op grootte. De resultaten hiervan zijn vergeleken met theoretische
fragmentlengtes afkomstig van het programma ApE. Het eiwitniveau bestaat uit SDS-PAGE (zichtbaar
maken van de eiwitten), de Bradford-methode (bepalen van de eiwitconcentratie) en de absorptie-
en fluorescentiemeting (bepaling van de aangeslagen toestand en de uitzending van licht van het
eiwit). Aan de hand van de gebruikte technieken kon een conclusie worden getrokken.
Resultaten
Uit de DNA-analyse kwam als resultaat dat de fragmentlengtes achtereenvolgend 1500, 2000 en
3000 KDa zijn. Aan de hand van deze resultaten is de Rf-waarde van de marker bepaald, waarna ook
de Rf-waarde van het onbekende eiwit bepaald kon worden. Dit kwam uit op 0,51, met een daarbij
horend molecuulgewicht van 33,9 KDa. Door middel van de Bradford-methode is vastgesteld dat de
concentratie van het eiwit 243,6 µg/mL is. Na Absorptiebepaling en fluorescentiebepaling van het
eiwit, bleek de absorptie te komen op 475 en 505 nm.
Conclusie
Na uitvoering van de technieken op DNA-niveau en eiwitniveau, konden meerdere berekeningen
gedaan worden. Na vergelijking van deze uitkomsten met theoretische eigenschappen van de vier
fluorescerende eiwitten, bleek het onbekende eiwit de meeste overeenkomsten te treffen met het
Cyaan Fluorescent Protein (CFP).
1
