MolMic
Les 1 en 2
Klassieke technieken
- Morfologie
- Bacterie kleuring (gramkleuring)
- Groei op kweek media onder verschillende laboratorium condities
- Fenotypering obv biologische kenmerken (identificatie) (API, VITEK)
Moderne technieken
- Rt PCR
- Sequencing
- MALDI-TOF
- Microscopie
- ELISA ect
Moleculaire technieken → mijlpalen
- James Watson en Francis (1953)
Ontrafeling dubbele helix structuur (nobelprijs 1962)
- Fred Sanger (1975)
Ontwikkeling efficiënte sequence methodiek (nobelprijs 1980)
- Kary Mullis (1983)
Uitvinding Polymerase Chain Reaction (nobelprijs 1994) (PCR)
- Roche (1992)
Eerste commerciële moleculaire test
Waar begin je als je DNA wil onderzoeken/aantonen
- DNA/RNA sequentie wil je weten
Welke stuk DNA gebruiken we voor bacteriën?
16s RNA (onderdeel van ribosoom die elk bacterie moet hebben)
PCR en QPCR
Gebruikt als identificatie methode op een moleculair lab
Targets:
- Soort-specifieke amplificatie van 16s rRNA gen
- Amplificatie van soort-specifieke genen (virulentie factoren)
- Amplificatie van familie-specifieke DNA fragmenten (huishoud genen → Voor glucose
metabolisme)
- Amplificatie van resistentie-genen (tegen antibiotica)
- Amplificatie van het hele genoom (duurt wel wat langer maar geeft wel alle informatie)
,Chemische strutuur DNA
Lange dubbele helix met suiker(deoxyribose)) + fosfaat buitenstructuur en base naan binnenzijde
Gestabiliseerd door Hbruggen tussen de basen
Strengen in tegenovergestelde richting en anti-parallel (reverse complement)
,DNA
- Een Purine (AG) bint altijd met pyrimidine (CT) → A-T met 2 Hbruggen
G-C met 3 H bruggen
Waarom is dit belangrijk?
Als je veel GC hebt dan is er een hogere smeltcurve nodig om ze uit elkaar te halen
RNA= Ribonucleic acid
- DNA heeft deoxyribose (suikergroep)
- RNA heeft ribose
- DNA heeft 2 strengen
- RNA heeft 1 streng
- DNA heeft Thymine
- RNA heeft Uracil
Werkt een PCR met RNA template? → Nee je gebruikt een cDNA template
Bij Reverse transcriptase ontstaat een DNA-RNA hybride
Transcriptie-translatie in prokaryoten
, Opdracht:
Stel je wilt een (realtime) PCR op gaan zetten voor een influenza virus. Wat moet je van dit virus
weten voordat je deze PCR kunt ontwerpen?
- DNA/RNA virus
- Sequentie voor primers
Essentiële ingrediënten PCR Mix
- Target DNA (gezuiverd)
- Alle 4 de dNTP’s
20-200 uM van alle 4 de dNTP’s → een te hoge concentratie kan synthesefouten
veroorzaken
- PCR-Buffer
Tris-HCl buffer van pH=7,8 is optimaal. Optioneel: Tween (stabiliseert Taq), BSA, eenwaardige
ionen
- Taq-DNA polymerase (zonder dit gebeurt er niks)
- MgCL2 → essentiële cofactor voor Taq en heeft stabiliserende effect
- Primers
Polymerase enzymen
- Taq DNA polymerase
Essentieel: hittestabiel → zo kunnen de strengen uit elkaar bij de eerste stap (95 graden C)
Snelle synthese
Gevoelig voor allerlei remmende stoffen (kan een nadeel zijn)
GEEN 3-5 exonucleoase activiteit, dus geen PROOFREADING (nadeel)
- Polymerase remmers:
Proteolytische enzymen (pronase, proteinase K)
Heparine, ijzerionen poryferine-skeletten (bloed)
DMSO (hoge concentratie)
Urinecomponenten en hoge zoutconcentraties
SDS
Ureum
Het is belangrijk dat de zuivering goed en netjes gaat je wilt dus geen remmers.
Primers
Les 1 en 2
Klassieke technieken
- Morfologie
- Bacterie kleuring (gramkleuring)
- Groei op kweek media onder verschillende laboratorium condities
- Fenotypering obv biologische kenmerken (identificatie) (API, VITEK)
Moderne technieken
- Rt PCR
- Sequencing
- MALDI-TOF
- Microscopie
- ELISA ect
Moleculaire technieken → mijlpalen
- James Watson en Francis (1953)
Ontrafeling dubbele helix structuur (nobelprijs 1962)
- Fred Sanger (1975)
Ontwikkeling efficiënte sequence methodiek (nobelprijs 1980)
- Kary Mullis (1983)
Uitvinding Polymerase Chain Reaction (nobelprijs 1994) (PCR)
- Roche (1992)
Eerste commerciële moleculaire test
Waar begin je als je DNA wil onderzoeken/aantonen
- DNA/RNA sequentie wil je weten
Welke stuk DNA gebruiken we voor bacteriën?
16s RNA (onderdeel van ribosoom die elk bacterie moet hebben)
PCR en QPCR
Gebruikt als identificatie methode op een moleculair lab
Targets:
- Soort-specifieke amplificatie van 16s rRNA gen
- Amplificatie van soort-specifieke genen (virulentie factoren)
- Amplificatie van familie-specifieke DNA fragmenten (huishoud genen → Voor glucose
metabolisme)
- Amplificatie van resistentie-genen (tegen antibiotica)
- Amplificatie van het hele genoom (duurt wel wat langer maar geeft wel alle informatie)
,Chemische strutuur DNA
Lange dubbele helix met suiker(deoxyribose)) + fosfaat buitenstructuur en base naan binnenzijde
Gestabiliseerd door Hbruggen tussen de basen
Strengen in tegenovergestelde richting en anti-parallel (reverse complement)
,DNA
- Een Purine (AG) bint altijd met pyrimidine (CT) → A-T met 2 Hbruggen
G-C met 3 H bruggen
Waarom is dit belangrijk?
Als je veel GC hebt dan is er een hogere smeltcurve nodig om ze uit elkaar te halen
RNA= Ribonucleic acid
- DNA heeft deoxyribose (suikergroep)
- RNA heeft ribose
- DNA heeft 2 strengen
- RNA heeft 1 streng
- DNA heeft Thymine
- RNA heeft Uracil
Werkt een PCR met RNA template? → Nee je gebruikt een cDNA template
Bij Reverse transcriptase ontstaat een DNA-RNA hybride
Transcriptie-translatie in prokaryoten
, Opdracht:
Stel je wilt een (realtime) PCR op gaan zetten voor een influenza virus. Wat moet je van dit virus
weten voordat je deze PCR kunt ontwerpen?
- DNA/RNA virus
- Sequentie voor primers
Essentiële ingrediënten PCR Mix
- Target DNA (gezuiverd)
- Alle 4 de dNTP’s
20-200 uM van alle 4 de dNTP’s → een te hoge concentratie kan synthesefouten
veroorzaken
- PCR-Buffer
Tris-HCl buffer van pH=7,8 is optimaal. Optioneel: Tween (stabiliseert Taq), BSA, eenwaardige
ionen
- Taq-DNA polymerase (zonder dit gebeurt er niks)
- MgCL2 → essentiële cofactor voor Taq en heeft stabiliserende effect
- Primers
Polymerase enzymen
- Taq DNA polymerase
Essentieel: hittestabiel → zo kunnen de strengen uit elkaar bij de eerste stap (95 graden C)
Snelle synthese
Gevoelig voor allerlei remmende stoffen (kan een nadeel zijn)
GEEN 3-5 exonucleoase activiteit, dus geen PROOFREADING (nadeel)
- Polymerase remmers:
Proteolytische enzymen (pronase, proteinase K)
Heparine, ijzerionen poryferine-skeletten (bloed)
DMSO (hoge concentratie)
Urinecomponenten en hoge zoutconcentraties
SDS
Ureum
Het is belangrijk dat de zuivering goed en netjes gaat je wilt dus geen remmers.
Primers
