TEMA 2. CROMATOGRAFÍA: PRINCIPIOS GENERALES
2.1. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
2.2. COMPORTAMIENTO CROMATOGRÁFICO DE LOS SOLUTOS
2.2.1. Comportamiento de retención
2.2.2. Coeficiente de distribución o de reparto
2.2.3. Factor de capacidad
2.2.4. Retención relativa o factor de selectividad
2.3. EFICIENCIA DE LA COLUMNA Y RESOLUCIÓN
2.3.1. Altura de plato y número de platos
2.3.2. Asimetría de la banda
2.3.3. Resolución
2.4. CONDICIONES CROMATOGRAFICAS
2.4.1. Procesos en la columna y ensanchamiento de la banda
2.4.2. Tiempo de análisis y resolución
2.5. APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA
2.5.1. Determinaciones cualitativas: datos de retención para la
caracterización de la muestra
2.5.2. Determinaciones cuantitativas
2.5.2.1. Integración del área del pico:
Integrador computarizado
2.5.2.2. Métodos de evaluación
, 2. Cromatografía. Principios generales
La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos
físicos y químicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente
inmiscibles. Una fase es estacionaria y la otra móvil. Una muestra que se introduce en la
fase móvil es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria
distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos)
entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en forma
apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase
móvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de
interacción con la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge primero, el
retenido más fuertemente eluye al último. El reparto entre las fases aprovecha las
diferencias entre las propiedades físicas y/o químicas de los componentes de la muestra.
La columna de separación es el corazón del cromatógrafo. Proporciona
versatilidad en los tipos de análisis que pueden realizarse. Esta característica, debida a
la amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y estacionaria, permite
separar moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas y químicas. En un
sentido amplio, la distribución de un soluto entre dos fases es el resultado del balance de
fuerzas entre las moléculas del soluto y las moléculas de cada fase. Refleja la atracción
o repulsión relativas que presentan las moléculas o iones de las fases competidoras por
el soluto y entre sí. Estas fuerzas pueden ser de naturaleza polar, proviniendo de
momentos dipolares permanentes o inducidos, o pueden deberse a fuerzas de dispersión
del tipo London. En cromatografía de intercambio iónico, las fuerzas en las moléculas
del soluto son sustancialmente de naturaleza iónica; pero incluyen también fuerzas
polares y no polares.
2.1. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
La fase móvil puede ser un gas o un líquido, mientras que la fase estacionaria
sólo puede ser un líquido o un sólido (Tabla 2. l) dando lugar a la cromatografía de
gases y a la cromatografía líquida
En la cromatografía líquida, cuando la separación involucra predominantemente
un reparto simple entre dos fases líquidas inmiscibles, una estacionaria y la otra móvil,
el proceso se llama cromatografía líquido-líquido (LLC). Cuando en la aptitud retentiva
de la fase estacionaria intervienen principalmente fuerzas físicas de superficie, el
proceso se denomina cromatografía líquido-sólido (LSC, de liquid-solid
chromatography) (o de adsorción).
Otros dos métodos de cromatografía líquida difieren un poco en su modo de
acción, En cromatografía de intercambio iónico (IEC, de ionic-exchange
chromatography), los componentes iónicos de la muestra se separan por el intercambio
2.1
, 2. Cromatografía. Principios generales
selectivo con contraiones de la fase estacionaria. En cromatografía de exclusión (EC, de
exclusión cromatography), la fase estacionaria proporciona una clasificación de
moléculas basadas en su mayor parte en la geometría y el tamaño molecular. Este
método también se llama cromatografía de permeación en gel, en la química de los
polímeros, y de filtración en gel, en la bioquímica
Cuando la fase móvil es un gas, los métodos se llaman cromatografía gas-
líquido (GLC), y cromatografía gas-sólido (GSC). Los métodos que implican fases
móviles gaseosas y líquidas, serán tratados en forma individual. Aun cuando hay pocas
razones fundamentales para estudios separados, las diferencias en las técnicas de
operación y en el equipo justifican su análisis en capítulos individuales.
Tabla 2.1. Métodos cromatográficos
2.2. COMPORTAMIENTO CROMATOGRÁFICO DE LOS SOLUTOS
El comportamiento cromatográfico de un soluto puede describirse de diversas
formas. Para cromatografía en columna, el volumen de retención, VR, (o el
correspondiente tiempo rentención, tR) y la razón de reparto, k', son los términos que se
utilizan con más frecuencia. Variando las combinaciones de fase estacionaria - fase
móvil y varios parámetros operación, el grado de retención se puede cambiar de cerca
de la retención total hasta estado de migración libre.
2.2.1. Comportamiento de retención
El comportamiento de retención refleja la distribución del soluto entre la fase
móvil y estacionaria. La Fig. 2.1 muestra la separación de dos alquenos isoméricos. El
volumen de fase móvil necesario para transportar la banda de soluto desde el punto de
inyección a través de la columna, hasta el detector (en el máximo del pico del soluto) se
define como volumen de retención, VR. Se puede obtener directamente del
cromatograma multiplicando el tiempo de retención correspondiente, tR , por el gasto o
flujo volumétrico, Fc expresado como el volumen de fase móvil por unidad de tiempo:
VR = tR·Fc
2.2
2.1. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
2.2. COMPORTAMIENTO CROMATOGRÁFICO DE LOS SOLUTOS
2.2.1. Comportamiento de retención
2.2.2. Coeficiente de distribución o de reparto
2.2.3. Factor de capacidad
2.2.4. Retención relativa o factor de selectividad
2.3. EFICIENCIA DE LA COLUMNA Y RESOLUCIÓN
2.3.1. Altura de plato y número de platos
2.3.2. Asimetría de la banda
2.3.3. Resolución
2.4. CONDICIONES CROMATOGRAFICAS
2.4.1. Procesos en la columna y ensanchamiento de la banda
2.4.2. Tiempo de análisis y resolución
2.5. APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA
2.5.1. Determinaciones cualitativas: datos de retención para la
caracterización de la muestra
2.5.2. Determinaciones cuantitativas
2.5.2.1. Integración del área del pico:
Integrador computarizado
2.5.2.2. Métodos de evaluación
, 2. Cromatografía. Principios generales
La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos
físicos y químicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente
inmiscibles. Una fase es estacionaria y la otra móvil. Una muestra que se introduce en la
fase móvil es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria
distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos)
entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en forma
apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase
móvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de
interacción con la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge primero, el
retenido más fuertemente eluye al último. El reparto entre las fases aprovecha las
diferencias entre las propiedades físicas y/o químicas de los componentes de la muestra.
La columna de separación es el corazón del cromatógrafo. Proporciona
versatilidad en los tipos de análisis que pueden realizarse. Esta característica, debida a
la amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y estacionaria, permite
separar moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas y químicas. En un
sentido amplio, la distribución de un soluto entre dos fases es el resultado del balance de
fuerzas entre las moléculas del soluto y las moléculas de cada fase. Refleja la atracción
o repulsión relativas que presentan las moléculas o iones de las fases competidoras por
el soluto y entre sí. Estas fuerzas pueden ser de naturaleza polar, proviniendo de
momentos dipolares permanentes o inducidos, o pueden deberse a fuerzas de dispersión
del tipo London. En cromatografía de intercambio iónico, las fuerzas en las moléculas
del soluto son sustancialmente de naturaleza iónica; pero incluyen también fuerzas
polares y no polares.
2.1. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
La fase móvil puede ser un gas o un líquido, mientras que la fase estacionaria
sólo puede ser un líquido o un sólido (Tabla 2. l) dando lugar a la cromatografía de
gases y a la cromatografía líquida
En la cromatografía líquida, cuando la separación involucra predominantemente
un reparto simple entre dos fases líquidas inmiscibles, una estacionaria y la otra móvil,
el proceso se llama cromatografía líquido-líquido (LLC). Cuando en la aptitud retentiva
de la fase estacionaria intervienen principalmente fuerzas físicas de superficie, el
proceso se denomina cromatografía líquido-sólido (LSC, de liquid-solid
chromatography) (o de adsorción).
Otros dos métodos de cromatografía líquida difieren un poco en su modo de
acción, En cromatografía de intercambio iónico (IEC, de ionic-exchange
chromatography), los componentes iónicos de la muestra se separan por el intercambio
2.1
, 2. Cromatografía. Principios generales
selectivo con contraiones de la fase estacionaria. En cromatografía de exclusión (EC, de
exclusión cromatography), la fase estacionaria proporciona una clasificación de
moléculas basadas en su mayor parte en la geometría y el tamaño molecular. Este
método también se llama cromatografía de permeación en gel, en la química de los
polímeros, y de filtración en gel, en la bioquímica
Cuando la fase móvil es un gas, los métodos se llaman cromatografía gas-
líquido (GLC), y cromatografía gas-sólido (GSC). Los métodos que implican fases
móviles gaseosas y líquidas, serán tratados en forma individual. Aun cuando hay pocas
razones fundamentales para estudios separados, las diferencias en las técnicas de
operación y en el equipo justifican su análisis en capítulos individuales.
Tabla 2.1. Métodos cromatográficos
2.2. COMPORTAMIENTO CROMATOGRÁFICO DE LOS SOLUTOS
El comportamiento cromatográfico de un soluto puede describirse de diversas
formas. Para cromatografía en columna, el volumen de retención, VR, (o el
correspondiente tiempo rentención, tR) y la razón de reparto, k', son los términos que se
utilizan con más frecuencia. Variando las combinaciones de fase estacionaria - fase
móvil y varios parámetros operación, el grado de retención se puede cambiar de cerca
de la retención total hasta estado de migración libre.
2.2.1. Comportamiento de retención
El comportamiento de retención refleja la distribución del soluto entre la fase
móvil y estacionaria. La Fig. 2.1 muestra la separación de dos alquenos isoméricos. El
volumen de fase móvil necesario para transportar la banda de soluto desde el punto de
inyección a través de la columna, hasta el detector (en el máximo del pico del soluto) se
define como volumen de retención, VR. Se puede obtener directamente del
cromatograma multiplicando el tiempo de retención correspondiente, tR , por el gasto o
flujo volumétrico, Fc expresado como el volumen de fase móvil por unidad de tiempo:
VR = tR·Fc
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