Samenvatting per leerdoel Genetica en Evolutie Psychobiologie jaar 1

GEN-ISOLATIE EN GENETISCHE MANIPULATIE (HC9, H10)

Leerdoelen
- Je kunt, gebruikmakend van onderstaande technieken en strategieën formuleren om
onderzoekshypotheses te testen:
o DNA-extractie
o mRNA-extractie
o cDNA-productie
o PCR
o Gelelektroforese
o Restrictie-enzymen
o Ligatie
o Kloneren/transfectie
o Sequencing
o Microarray (h 14, maar zie ook Array CGH h17 (al behandeld) )
o CRISPR/Cas9
o Transgene dieren (boek)

DNA-extractie
1) Cellen verzamelen
2) Cellen kapot maken
o Lysisbuffer + warm waterbad  cel- & kernmembraan gaan kapot, histonen
gaan kapot zodat DNA vrijkomt.
3) DNA scheiden van proteïnes etc.
o Geconcentreerde zoutoplossing  proteïnes etc. klonteren samen
o Centrifuge  proteïnes etc. zinken naar de bodem
o Overgebleven DNA-oplossing in ander epje.
4) Geconcentreerd DNA isoleren
o Isopropyl alcohol  DNA klontert samen
o Centrifuge  DNA zakt naar de bodem
o Verwijder overgebleven oplossing en laat DNA drogen


cDNA-productie
Stappen
1) Isoleer mRNA uit weefsel dmv van vissen met poly-T staart (mRNA-extractie).
2) cDNA productie dmv reverse transcriptase
o Primer (oligo dT) bindt aan mRNA template
o Reverse transcriptase  complementaire DNA-streng
o RNase  afbraak mRNA
o Oligonucleotide bindt aan ‘3 kant van cDNA
o DNA-ploymerase I en dNTP’s verlengen tot dubbelstrengs DNA

3)

,PCR
Benodigdheden
- Buffer (pH, zout, Mg2+)
- Template DNA (dubbelstrengs DNA dat target regio bevat)
- Primers (korte stukjes enkelstrengs DNA)
o Forward primer bindt aan onderste streng, leest 5’ – 3’.
o Reverse primer bindt aan bovenste streng.
o Primers zijn deel van het eindproduct.
o Lengte = 16-25 nucleotiden
- dNTP’s
- Taq-polymerase (hitte resistent)

Stappen
1) Denaturatie (95): waterstofbruggen breken  enkelstrengs DNA
2) Annealing (45-70): primers binden aan complementaire sequenties
3) Elongation (72): Taq-polymerase start DNA-synthese vanaf primers


Agarose gelelektroforese
DNA is negatief geladen.

Gebruik
Grote mutaties
- Deletie of duplicatie > 50 bp

Kleine mutaties
- SNP, insertie of deletie
- Ontwikkel een selectieve primer
o WT  geen PCR-product
o M  wel PCR-product


Kloneren en transfectie dmv vectoren
Transfectie = construct in expressie systeem brengen
- Methode 1: PCR-producten met sticky-ends, primer bevat restriction site.
- Methode 2: Linkers, stukjes DNA met restriction site worden aan DNA geplakt.

Vector = artificieel construct dat vreemd DNA de cel in brengt (bijv. plasmide)

Een insert in een vector kloneren
- Restrictie-enzymen knippen specifieke DNA-sequenties in…
o insert-DNA  sticky-ends
o vector-DNA  sticky ends
- Ligase plakt twee DNA-fragmenten aan elkaar door fosfordiester-bindingen te
katalyseren.

, Sequencing
Voordelen:
- Slechts 1 reactie
- Langere reads mogelijk

Sanger sequencing
- Gemodificeerde basen
- Slechte kwaliteit: 15-40 & 700-900+


Microarray (H14)
Waarom?
Verschil in genexpressie tussen twee verschillende cellen meten.

Stappen
1) mRNA-isolatie dmv poly-T staarten
2) cDNA-productie met gelabelde nucleotiden
3) Microarray hybridisatie (vorming bindingen tussen complementaire strengen)
o Microarray plaatje bevat in elk putje een cDNA-streng die complementair is
aan de mogelijk aan te treffen cDNA’s.
4) Level hybridisatie berekenen (door computer)
o Wit = genexpressie van gen beide soort cellen
o Rood = meer genexpressie van gen in rood gelabelde cellen
o Groen = minder genexpressie van gen in rood gelabelde cellen
o Geen kleur = geen genexpressie van dit gen

Kan niet:
- Laten zien welke genen slecht zijn (of ziektes veroorzaken).
- Ziektes genezen.
- Alle niet-juist werkende genen identificeren.


RT-qPCR = hoeveelheid RNA in weefsel kwantificeren