Thema 1: DNA structuur, genexpressie en mutaties
ZSO-1: DNA structuur, genexpressie en mutaties
Je weet in detail hoe in eukaryotische cellen de normale "flow" van genetische informatie van DNA,
naar mRNA en vervolgens eiwitten verloopt en is georganiseerd.
● Het centrale dogma stelt dat genetische informatie opgeslagen in het DNA via transcriptie wordt
overgedragen naar mRNA, wat vervolgens getransleerd wordt tot eiwitten.
● Transcriptie: DNA → mRNA
● Transcriptie wordt geïnitieerd door RNA polymerase II bij de 5’-UTR, een regio in het 5’-einde
van het exon dat niet getransleerd wordt.
● Transcriptie verloopt in een 5’ → 3’ richting. De streng DNA die als template gebruikt wordt
loopt dus relatief gezien van 3’ → 5’ en wordt de antisense (noncoding) streng genoemd. De
niet-getranscribeerde streng (5’ → 3’) wordt de sense (coding) streng genoemd.
● Na transcriptie vinden er enkele modificaties van het primaire RNA transcript plaats.
● 1) 5’-capping: hierbij worden er speciaal gemethyleerde guanosines boven de 5’-UTR
toegevoegde. Dit zorgt voor i) bescherming tegen 5'-> 3' exonucleases, ii) transport van de kern
naar cytoplasma, iii) mogelijk maken van splicing, iv) binding van de 40S ribosoom subunit aan
het mRNA.
● 2) 3’-polyadenylering: hierbij wordt na de AAUAAA sequentie in de 3’-UTR repetitieve adenines
toegevoegd. Dit zorgt voor: i) transport van het mRNA naar het cytoplasma, ii) stabilisering van
het mRNA in het cytoplasma, iii) verbeterde herkenning van het mRNA door de ribosomen zodat
translatie kan plaats vinden.
● 3) Splicing: hierbij worden intronen uit het RNA verwijderd. Dit process verloopt in verschillende
stappen.
○ i) Knippen van 5’-splice site: GT/GU dinucleotide direct 5’ van het intron (3’ exon-intron)
○ ii) Vorming lassovormige structuur.
○ iii) Knippen 3’-splice site: AG dinucleotide direct 3’ van het intron (5’ exon-intron)
● Transcriptie wordt gereguleerd door transcriptiefactoren die bijvoorbeeld aan promoter regio’s,
boven het 5’-einde van het gen, binden. Enkele van dit soort regio’s zijn de TATA box en
CAT-box(CCAAT). I.p.v. boxen kunnen het soms ook CpG-eilandjes zijn. Enhancers kunnen
eenzelfde effect hebben als promotors, maar kunnen over een langere afstand werken en zijn
zowel 5’ als 3’- georiënteerd.
● Translatie: mRNA → eiwit
● Translatie begint bij het startcodon AUG/ATG, dat codeert voor methionine. Het startcodon
bepaalt het reading frame van het mRNA.
, ● Elk codon (3 bp) op het mRNA matcht met het anticodon op tRNA. Door de interactie tussen het
anticodon en het codon brengt het aminozuur op de juiste plaats waardoor het aan het
carboxyl-eind van de groeiende polypeptide toegevoegd kan worden.
● Zodra een van de 3 stop codons (UAG, UGA, UAA) bereikt wordt stopt translatie.
Je bent bekend met de moleculaire processen die verantwoordelijk zijn voor accurate replicatie van
het DNA en de verdeling van de chromosomen over de dochtercellen tijdens de celdeling.
● DNA replicatie vindt plaats tijdens de S-fase van de celcyclus.
● DNA replicatie begint bij een origin of replication. Nadat replicatie factoren binden breken
helicases de dubbele helix open en kan het replicatie apparaat binden om replicatie uit te
voeren.
● Replicatie verloopt bidirectioneel: zowel op de leading als lagging strand.
● DNA polymerases kunnen alleen verlengen in een 5’ → 3’ richting en hebben een vrije
3’-hydroxylgroep nodig. Hiervoor maakt primase een DNA primer, waaraan DNA polymerase α
nog een aantal nucleotide aan toevoegt. Vervolgens nemen DNA polymerase δ/ε het over.
● De lagging strand wordt op niet-continue wijze gerepliceerd, waardoor okazaki fragmenten
ontstaan. Voor ieder okazaki fragment wordt er geprimeerd en geligeerd.
● Na replicatie zijn er 2 identieke zuster chromatiden die bij de centromeer aan elkaar vast zitten
en een kinetochore complex vormen. Bij het kinetochore complex binden de mitotische vezels,
zodat de zusterchromatiden correct gescheiden kunnen worden tijdens anafase.
,Je begrijpt hoe verschillende typen mutaties de functionaliteit van een gen aan kunnen tasten.
● Mutaties zijn permanente veranderingen in de DNA sequentie. Er zijn verschillende niveaus waar
een mutatie toe kunnen behoren waaronder gen mutaties, (sub)chromosomale mutaties.
● Gen mutaties zijn mutaties waardoor de DNA sequentie in een specifiek gen wordt aangepast en
daardoor mogelijk ook de functionaliteit van het gen of het mRNA dat het gen produceert.
● Daarnaast zijn mutaties de oorzaak voor genetische variatie. Als een variatie een allel frequentie
heeft van >1% wordt het een polymorfisme genoemd.
● Gen mutaties zijn vaak deleties, inserties of substituties en kunnen zowel in intronen als exonen
een effect hebben.
Type mutatie Wat Effect
Missense Een puntmutatie waardoor er een Veranderde aminozuur kan functie
aminozuur verandert. van het eiwit beïnvloeden, maar
niet per definitie.
Nonsense Een puntmutatie waardoor er een vervroegd Er wordt een verkort eiwit
stopcodon is of stopcodon verdwijnt. geproduceerd dat vaak niet
functioneel is en wordt afgebroken.
Translatie kan juist ook doorgaan
waardoor eiwit te lang wordt.
Splice-site 1) Een deletie, insertie of substitutie 1) Intronen kunnen niet goed
waardoor de splice site verdwijnt. verwijderd worden; soms worden
2) Een substitutie waardoor een alternatieve alternatieve (cryptische) splice sites
splice site ontstaat. geactiveerd.
2) Mutaties in cryptische splice site,
waardoor deze meer op originele
donor (5’) of acceptor (3’) splice site
lijkt en actief wordt.
RNA processing Mutaties in cap sites en polyadenylering Gebrek aan desbetreffende RNA
sites. processing kan stabiliteit van RNA
verstoren en voor premature
afbraak of gebrekkig transport
zorgen.
Copy number Variant in kopie nummer van gen. Oorzaak: Kan frameshift veroorzaken met
variant (CNV) - Deletie: Een stuk DNA wordt verwijdert. premature stop of veranderde
- Insertie: Een stuk DNA wordt toegevoegd. aminozuur sequentie.
- Duplicatie: segment wordt gedupliceerd.
Dynamische De verandering in DNA sequentie is actief in Expansie in exon zorgt voor
mutatie individuen en amplificeert vaak over abnormaal eiwit product. Expansie
generaties. Bijvoorbeeld unstable repeat in intron verstoort RNA processing.
expansie.
, ZSO-2: Moleculaire technieken
Blotting en hybridisatie (Southern, Northern, Western)
● Alle blotting technieken berusten op scheiding d.m.v. gelelektroforese, transfer naar een
membraan en detectie van het product.
Type blot Moleculaire principe Toepassing
Southern (DNA) - Knippen DNA restrictie enzymen. - Herkennen van bepaalde DNA
- Scheiding fragmenten op grootte sequenties en afwijkingen door
- Hybridisatie met DNA probe grootte van fragment te vergelijken
- Transfer naar membraan met referentie gen
Northern (RNA) - Scheiding fragmenten op grootte - Analyseren van genexpressie
- Hybridisatie met DNA/RNA/oligo probe patronen: mate van expressie
- Transfer naar membraan afhankelijk van hoeveelheid mRNA.
Western (Eiwitten) - Behandeling eiwitten met SDS → alle - Herkennen mate van expressie van
eiwitten negatief eiwitten door kwantificatie van eiwit
- Scheiding fragmenten op grootte op membraan.
- Transfer naar membraan - Identificatie van bepaalde eiwitten.
- Blocking membraan
- Immunoblotting en detectie.
ZSO-1: DNA structuur, genexpressie en mutaties
Je weet in detail hoe in eukaryotische cellen de normale "flow" van genetische informatie van DNA,
naar mRNA en vervolgens eiwitten verloopt en is georganiseerd.
● Het centrale dogma stelt dat genetische informatie opgeslagen in het DNA via transcriptie wordt
overgedragen naar mRNA, wat vervolgens getransleerd wordt tot eiwitten.
● Transcriptie: DNA → mRNA
● Transcriptie wordt geïnitieerd door RNA polymerase II bij de 5’-UTR, een regio in het 5’-einde
van het exon dat niet getransleerd wordt.
● Transcriptie verloopt in een 5’ → 3’ richting. De streng DNA die als template gebruikt wordt
loopt dus relatief gezien van 3’ → 5’ en wordt de antisense (noncoding) streng genoemd. De
niet-getranscribeerde streng (5’ → 3’) wordt de sense (coding) streng genoemd.
● Na transcriptie vinden er enkele modificaties van het primaire RNA transcript plaats.
● 1) 5’-capping: hierbij worden er speciaal gemethyleerde guanosines boven de 5’-UTR
toegevoegde. Dit zorgt voor i) bescherming tegen 5'-> 3' exonucleases, ii) transport van de kern
naar cytoplasma, iii) mogelijk maken van splicing, iv) binding van de 40S ribosoom subunit aan
het mRNA.
● 2) 3’-polyadenylering: hierbij wordt na de AAUAAA sequentie in de 3’-UTR repetitieve adenines
toegevoegd. Dit zorgt voor: i) transport van het mRNA naar het cytoplasma, ii) stabilisering van
het mRNA in het cytoplasma, iii) verbeterde herkenning van het mRNA door de ribosomen zodat
translatie kan plaats vinden.
● 3) Splicing: hierbij worden intronen uit het RNA verwijderd. Dit process verloopt in verschillende
stappen.
○ i) Knippen van 5’-splice site: GT/GU dinucleotide direct 5’ van het intron (3’ exon-intron)
○ ii) Vorming lassovormige structuur.
○ iii) Knippen 3’-splice site: AG dinucleotide direct 3’ van het intron (5’ exon-intron)
● Transcriptie wordt gereguleerd door transcriptiefactoren die bijvoorbeeld aan promoter regio’s,
boven het 5’-einde van het gen, binden. Enkele van dit soort regio’s zijn de TATA box en
CAT-box(CCAAT). I.p.v. boxen kunnen het soms ook CpG-eilandjes zijn. Enhancers kunnen
eenzelfde effect hebben als promotors, maar kunnen over een langere afstand werken en zijn
zowel 5’ als 3’- georiënteerd.
● Translatie: mRNA → eiwit
● Translatie begint bij het startcodon AUG/ATG, dat codeert voor methionine. Het startcodon
bepaalt het reading frame van het mRNA.
, ● Elk codon (3 bp) op het mRNA matcht met het anticodon op tRNA. Door de interactie tussen het
anticodon en het codon brengt het aminozuur op de juiste plaats waardoor het aan het
carboxyl-eind van de groeiende polypeptide toegevoegd kan worden.
● Zodra een van de 3 stop codons (UAG, UGA, UAA) bereikt wordt stopt translatie.
Je bent bekend met de moleculaire processen die verantwoordelijk zijn voor accurate replicatie van
het DNA en de verdeling van de chromosomen over de dochtercellen tijdens de celdeling.
● DNA replicatie vindt plaats tijdens de S-fase van de celcyclus.
● DNA replicatie begint bij een origin of replication. Nadat replicatie factoren binden breken
helicases de dubbele helix open en kan het replicatie apparaat binden om replicatie uit te
voeren.
● Replicatie verloopt bidirectioneel: zowel op de leading als lagging strand.
● DNA polymerases kunnen alleen verlengen in een 5’ → 3’ richting en hebben een vrije
3’-hydroxylgroep nodig. Hiervoor maakt primase een DNA primer, waaraan DNA polymerase α
nog een aantal nucleotide aan toevoegt. Vervolgens nemen DNA polymerase δ/ε het over.
● De lagging strand wordt op niet-continue wijze gerepliceerd, waardoor okazaki fragmenten
ontstaan. Voor ieder okazaki fragment wordt er geprimeerd en geligeerd.
● Na replicatie zijn er 2 identieke zuster chromatiden die bij de centromeer aan elkaar vast zitten
en een kinetochore complex vormen. Bij het kinetochore complex binden de mitotische vezels,
zodat de zusterchromatiden correct gescheiden kunnen worden tijdens anafase.
,Je begrijpt hoe verschillende typen mutaties de functionaliteit van een gen aan kunnen tasten.
● Mutaties zijn permanente veranderingen in de DNA sequentie. Er zijn verschillende niveaus waar
een mutatie toe kunnen behoren waaronder gen mutaties, (sub)chromosomale mutaties.
● Gen mutaties zijn mutaties waardoor de DNA sequentie in een specifiek gen wordt aangepast en
daardoor mogelijk ook de functionaliteit van het gen of het mRNA dat het gen produceert.
● Daarnaast zijn mutaties de oorzaak voor genetische variatie. Als een variatie een allel frequentie
heeft van >1% wordt het een polymorfisme genoemd.
● Gen mutaties zijn vaak deleties, inserties of substituties en kunnen zowel in intronen als exonen
een effect hebben.
Type mutatie Wat Effect
Missense Een puntmutatie waardoor er een Veranderde aminozuur kan functie
aminozuur verandert. van het eiwit beïnvloeden, maar
niet per definitie.
Nonsense Een puntmutatie waardoor er een vervroegd Er wordt een verkort eiwit
stopcodon is of stopcodon verdwijnt. geproduceerd dat vaak niet
functioneel is en wordt afgebroken.
Translatie kan juist ook doorgaan
waardoor eiwit te lang wordt.
Splice-site 1) Een deletie, insertie of substitutie 1) Intronen kunnen niet goed
waardoor de splice site verdwijnt. verwijderd worden; soms worden
2) Een substitutie waardoor een alternatieve alternatieve (cryptische) splice sites
splice site ontstaat. geactiveerd.
2) Mutaties in cryptische splice site,
waardoor deze meer op originele
donor (5’) of acceptor (3’) splice site
lijkt en actief wordt.
RNA processing Mutaties in cap sites en polyadenylering Gebrek aan desbetreffende RNA
sites. processing kan stabiliteit van RNA
verstoren en voor premature
afbraak of gebrekkig transport
zorgen.
Copy number Variant in kopie nummer van gen. Oorzaak: Kan frameshift veroorzaken met
variant (CNV) - Deletie: Een stuk DNA wordt verwijdert. premature stop of veranderde
- Insertie: Een stuk DNA wordt toegevoegd. aminozuur sequentie.
- Duplicatie: segment wordt gedupliceerd.
Dynamische De verandering in DNA sequentie is actief in Expansie in exon zorgt voor
mutatie individuen en amplificeert vaak over abnormaal eiwit product. Expansie
generaties. Bijvoorbeeld unstable repeat in intron verstoort RNA processing.
expansie.
, ZSO-2: Moleculaire technieken
Blotting en hybridisatie (Southern, Northern, Western)
● Alle blotting technieken berusten op scheiding d.m.v. gelelektroforese, transfer naar een
membraan en detectie van het product.
Type blot Moleculaire principe Toepassing
Southern (DNA) - Knippen DNA restrictie enzymen. - Herkennen van bepaalde DNA
- Scheiding fragmenten op grootte sequenties en afwijkingen door
- Hybridisatie met DNA probe grootte van fragment te vergelijken
- Transfer naar membraan met referentie gen
Northern (RNA) - Scheiding fragmenten op grootte - Analyseren van genexpressie
- Hybridisatie met DNA/RNA/oligo probe patronen: mate van expressie
- Transfer naar membraan afhankelijk van hoeveelheid mRNA.
Western (Eiwitten) - Behandeling eiwitten met SDS → alle - Herkennen mate van expressie van
eiwitten negatief eiwitten door kwantificatie van eiwit
- Scheiding fragmenten op grootte op membraan.
- Transfer naar membraan - Identificatie van bepaalde eiwitten.
- Blocking membraan
- Immunoblotting en detectie.
