Samenvatting onderdeel (q)PCR moleculaire detectie 2

SAMENVATTING ONDERDEEL qPCR

1. PCR en RT-PCR
1.1 PCR
Alle PCR’s zijn gebaseerd op hetzelfde principe met dezelfde stappen:
1. Denatureren bij 95 graden
2. Hybridisatie bij 55 graden
3. Elongatie bij 72 graden

PCR-producten worden gevisualiseerd op een agarosegel
 Eindpunt PCR

Eind-punt PCR:
 Geen informatie over de kinetiek van de reactie
 Geen informatie over de starthoeveelheid van de sjabloon
 Geen informatie over de effectiviteit van de amplificatie

1.2 RT-PCR
Reverse transcriptase PCR:
 Maakt van RNA cDNA
o Moet eerst naar cDNA, omdat RNA niet stabiel is
 Het enzym dat gebruikt wordt is Reverse transcriptase
 Verder heb je nodig
o Primers
o dNTPs
o Water
o Buffer
 Daagt het oorspronkelijke centrale dogma van de moleculaire biologie uit
 RNA-afhankelijke DNA-polymerasen
 Wat doe je bij RT-PCR:
o Isoleer totaal RNA of mRNA
o RNA moet je controleren op kwaliteit (bv nanodrop)
o Genomisch DNA eruit halen, zodat je alleen maar RNA overhoudt
 Dnase I

RT-PCR primers
 Drie soorten:
o Oligo(dT) primers
 Specifiek voor poly(A) staarten
 Alleen eukaryote mRNA's
 Verankerde oligo (dT) is gemodificeerd aan 3'end
o Random primers
 Korte, random sequenties
 RT-PCR of RNA zonder poly(A) staarten
o Gen-specifieke primers
 Ontworpen op basis van bekende volgorde
 miRNA

, 2. qPCR
2.1 basis van qPCR
qPCR:
 quantitatieve PCR (of Real-time PCR)
o Gevoelig en betrouwbaar
o Kwantitatief door fluorescent signaal tijdens amplificatie
o Hoeveelheid product kan na elke cyclus worden gevisualiseerd
 Resultaten
o Fluorescerend signaal elke cyclus
o Ct-waarde is evenredig met invoerbedragen
o Meer cycli
 Minder DNA
 Fluorescerende kleurstoffen
o DNA-bindende middelen
 SYBR green
o Hydrolysesondes
 Taqman-probe

qPCR gebruik je wanneer je dingen wil kwatificeren:
 Kwantificering van nucleïnezuren
 1 of 2 of 3 (maximaal 20?) DNA/RNA-doelen
 Doel is bekend

2.2 kleurstoffen
SYBR green:
 Fluorescerende kleurstof
 Bindt aan dsDNA (dubbelstrengs DNA)
 Straalt licht uit wanneer gebonden
 Meer fluorescerend signaal duidt op meer product
 Niet specifiek, kan aan al het dubbelstrengs DNA binden

Taqman:
 Kleurstof en quencher (demper > geen signaal) op een ssDNA (enkelstrengs DNA)
 Probe bindt aan complementair DNA-fragment
 Nieuw gesysnthetiseerde stam verdringt de sonde, waardoor fluorofoor vrijkomt
 Elke cyclus meer fluorescentie


3. Primer design
Voor het kiezen van primers wordt onderscheid gemaakt tussen gDNA en (mRNA/)cDNA
Exon/exon border = er zijn geen intronen aanwezig.
Primers zijn specifiek voor cDNA, omdat gDNA nog intronen bevat.
Splice varianten = extra exon verwijderd
Geeft product lengte van 80-200bp

Doel: Bepalen of de expressie van een gen omhoog of omlaag gaat
We gaan hoeveelheid transcript meten van enkele specifieke genen