Biotechnologie
en Maatschappij
Biotechnologie Deeltoets 1 & 2
Jaar 1, periode 3
Bevat alle uitgewerkte leerdoelen
DNA gebonden door H-bruggen (strengen) en fosfodiesterbindingen (nucleotiden).
DNA replicatie: helicase, single strand binding proteins, primase, DNA polymerase (III bouwt nucleotiden aan 3’ kant primer, I
vervangt primers voor DNA nucleotiden) en ligase.
Het centrale dogma: informatie overdracht van DNA, naar RNA, naar eiwit
Na replicatie: Chromosomen aanwezig als zusterchromatides, bevestigd bij het centromeer. Korte arm (p-arm) en lange arm (q-
arm). Karyotype: afbeelding chromosomen, zoals deze tijdens een bepaald stadium van de celdeling te zien zijn onder de
microscoop. We hebben 22 paar autosomale chromosomen en 1 paar geslachtschromosomen. Bij vrouwen wordt er blijvend 1
X-chromosoom geïnactiveerd
TRANSCRIPTIE
Prokaryoten: transcriptie & translatie gekoppeld (geen kern)
Start transcriptie: Pribnow box
Stop transcriptie: Terminatie sequentie
Operon structuur: 1 promoter, meerdere genen (polycistronisch)
Regulatie transcriptie: regulatie door positieve regulatie met een activator (bindt activator-bindings site) of negatieve regulatie
door repressie of inductie (bindt operator).
Eukaryoten: Maken gebruik van algemene transcriptiefactoren.
Start transcriptie: TATA box & CAAT box
Stop transcriptie: Polyadenylatie sequentie
RNA processing (posttranscriptionele modificaties):
1
, 5’ capping Gemodificeerde G nucleotide aan mRNA: de 5’ cap
Polyadenylatie 100-300 A nucleotiden aan 3' einde waardoor een poly-A-staart ontstaat.
De 5' cap en poly-A-staart zijn belangrijk voor transport uit de kern en beschermen mRNA tegen afbraak. Ze zijn ook belangrijk
voor translatie.
RNA splicing, verwijderen intronen (niet-coderende delen) en exonen koppelen. Er kunnen ook exonen verwijdert
worden waardoor er meerdere eiwitten gemaakt kunnen worden uit één pre-mRNA (alternatieve splicing).
Regulatie transcriptie:
Negatieve regulatie→ Repressor eiwitten binden aan silencers
Positieve regulatie → Activatoren binden aan enhancer sequenties
Na binden activatoren buigt het DNA eiwit-bindende domeinen op de activatoren hechten zich aan transcriptie factoren en
helpen hen bij het vormen van een actief transcriptie-initiatie complex op de promoter, wat RNA synthese door RNA polymerase
stimuleert.
TRANSLATIE
Initiatie
Prokaryoten: kleine ribosomale subeenheid en Eukaryoten: kleine ribosomale subeenheid en
initiatiefactoren herkennen een Shine Dalgarno sequentie initiatiefactoren herkennen 5’ cap kleine subeenheid
binding initiator tRNA binding grote ribosomale beweegt naar startcodon initiator tRNA bindt binding
subeenheid grote ribosomale subeenheid
Elongatie
Codonherkenning (A-site), peptidebinding (A-site), translocatie (P-site).
Terminatie
Release factor (eiwit) herkent stopcodon, peptide komt vrij, ribosomale subeenheden dissociëren. Dit proces kost energie, komt
vrij door hydrolyse van GTP.
Recombinant DNA technologie (combineren verschillende DNA moleculen).
1. DNA geknipt met restrictie enzymen.
2. DNA geplakt in vector m.b.v. ligase
3. Vector wordt geïntroduceerde in een organisme.
Restrictie enzymen knippen DNA op specifieke herkenningssequentie (6-9 basenparen, meestal genetisch palindroom).
Afkomstig uit bacteriën als verdediging tegen vreemd DNA (eigen DNA beschermd door methylatie).
Na knippen hebben de fragmenten ‘blunt ends' (recht geknipt, geen stukje uitstekende streng) of 'sticky ends' ook wel 'cohesive
ends’. Na digestie kunnen ‘cohesive ends' H-bruggen vormen met bijv. een plasmide (recombinant DNA) daarvoor moeten ze
wel geknipt zijn door hetzelfde restrictie enzym.
Plasmiden (6-12 kb) Makkelijk geïsoleerd & ingebracht. Geoptimaliseerd door mens voor kloneren. Expressie
vector : plasmide/virus voor genexpressie in cellen
Bacteriofagen (35 kb) DNA geïnjecteerd, meegenomen in de replicatiecylcus
Cosmide (45 kb) Plasmide met cos site (herkenningssite op virus-DNA voor assembleren virus deeltjes), ook
ingepakt in eiwitmantel gebruikt om cellen te infecteren. Het DNA wordt geïnjecteerd
maar gedraagt zich daarna als een normale plasmide.
Bacterial artificial chromosomes Genetisch gemodificeerde F-plasmiden ongeschikt on eiwitten tot expressie te brengen
(BACs) (300 kb)
Yeast artificial chromosomes Genetische gemodificeerde genomen die in gist repliceren
(YACs) (200-2000 kb)
VECTOREN
Niveaus van het reguleren van eiwitproductie:
- Chromatine modificatie
- Transcriptie regulatie
- Post-transcriptionele regulatie; alternatieve splicing
2
, - RNA interferentie
- Regulatie op niveau van eiwit (fosforylatie/defosforylatie)
Eiwitten herkennen breuk, ontwinden
de DNA helix. Ze breken aan de 5’ kant
een (deel van) een streng af (end
processing) enkelstrengs 3’uiteinde.
Strand invasion vindt plaats; het
enkelstrengs DNA gaat basenparen met
een complementaire streng van een
ander homoloog DNA molecuul (bv
tweede exemplaar van chromosoom).
Dit gaat vaak fout omdat er nucleotiden
ontbreken en er een deletie kan ontstaan. DNA polymerase kan dan weer gaan
aanbouwen. Er ontstaat een kruisvormige structuur, een holliday junction. Deze holliday
junctions worden geknipt
Als laatste volgt ligatie (resolution).
CRISPR als immuunsysteem
1. Herkenning & afbraak vreemd viraal DNA
2. Inbouw vreemd DNA als spacer in CRISPR gebied
3. Spacer en CRISPR DNA wordt afgeschreven naar crRNA
4. crRNA bindt tracrRNA
5. tracrRNA bindt met crRNA aan Cas9 eiwit
6. Cas9crRNA complex knipt DNA sequenties die (1) overeenkomen met crRNA én (2) daarvoor een PAM sequentie
bevatten.
3 toepassingen CRISPR:
Vaccinatie functionele bacteriën
Evolutionair onderzoek bacteriën
Genome editing.
Wij hebben guide RNA (gRNA) gemaakt, samengesteld van crRNA (dat complementair is aan het gen dat je wil aanpassen), en
tracrRNA (dat een complex vormt met het Cas9 eiwit).
Je kan Cas9 en gRNA op verschillende manieren introduceren in een cel:
1. Cas9 DNA & gRNA DNA
2. Cas9 mRNA & gRNA.
3. Cas9 eiwit & gRNA
CRISPR als gene editing techniek:
uitschakelen van een specifiek gen
gRNA (net crRNA deel complementair aan specifiek gen) en Cas9 eiwit.
Als het crRNA complementair is, en er een PAM sequentie aanwezig is, kan Cas9 knippen op deze specifieke locatie. DNA kan
hersteld worden door non-homologues end joining, maar dit kan leiden tot deleties. Zo introduceer je op een specifieke plek een
Mutatie.
Introduceren van een sequentie →
gRNA (met crRNA complementair aan specifieke locatie), Cas9 eiwit en DNA fragment (met homologe domeinen aan specifieke
locatie).
Als het crRNA complementair is, en er een PAM sequentie aanwezig, knipt Cas9. De Knip wordt hersteld door homologe
recombinatie met het DNA fragment.
Voordelen CRISPR :
3
en Maatschappij
Biotechnologie Deeltoets 1 & 2
Jaar 1, periode 3
Bevat alle uitgewerkte leerdoelen
DNA gebonden door H-bruggen (strengen) en fosfodiesterbindingen (nucleotiden).
DNA replicatie: helicase, single strand binding proteins, primase, DNA polymerase (III bouwt nucleotiden aan 3’ kant primer, I
vervangt primers voor DNA nucleotiden) en ligase.
Het centrale dogma: informatie overdracht van DNA, naar RNA, naar eiwit
Na replicatie: Chromosomen aanwezig als zusterchromatides, bevestigd bij het centromeer. Korte arm (p-arm) en lange arm (q-
arm). Karyotype: afbeelding chromosomen, zoals deze tijdens een bepaald stadium van de celdeling te zien zijn onder de
microscoop. We hebben 22 paar autosomale chromosomen en 1 paar geslachtschromosomen. Bij vrouwen wordt er blijvend 1
X-chromosoom geïnactiveerd
TRANSCRIPTIE
Prokaryoten: transcriptie & translatie gekoppeld (geen kern)
Start transcriptie: Pribnow box
Stop transcriptie: Terminatie sequentie
Operon structuur: 1 promoter, meerdere genen (polycistronisch)
Regulatie transcriptie: regulatie door positieve regulatie met een activator (bindt activator-bindings site) of negatieve regulatie
door repressie of inductie (bindt operator).
Eukaryoten: Maken gebruik van algemene transcriptiefactoren.
Start transcriptie: TATA box & CAAT box
Stop transcriptie: Polyadenylatie sequentie
RNA processing (posttranscriptionele modificaties):
1
, 5’ capping Gemodificeerde G nucleotide aan mRNA: de 5’ cap
Polyadenylatie 100-300 A nucleotiden aan 3' einde waardoor een poly-A-staart ontstaat.
De 5' cap en poly-A-staart zijn belangrijk voor transport uit de kern en beschermen mRNA tegen afbraak. Ze zijn ook belangrijk
voor translatie.
RNA splicing, verwijderen intronen (niet-coderende delen) en exonen koppelen. Er kunnen ook exonen verwijdert
worden waardoor er meerdere eiwitten gemaakt kunnen worden uit één pre-mRNA (alternatieve splicing).
Regulatie transcriptie:
Negatieve regulatie→ Repressor eiwitten binden aan silencers
Positieve regulatie → Activatoren binden aan enhancer sequenties
Na binden activatoren buigt het DNA eiwit-bindende domeinen op de activatoren hechten zich aan transcriptie factoren en
helpen hen bij het vormen van een actief transcriptie-initiatie complex op de promoter, wat RNA synthese door RNA polymerase
stimuleert.
TRANSLATIE
Initiatie
Prokaryoten: kleine ribosomale subeenheid en Eukaryoten: kleine ribosomale subeenheid en
initiatiefactoren herkennen een Shine Dalgarno sequentie initiatiefactoren herkennen 5’ cap kleine subeenheid
binding initiator tRNA binding grote ribosomale beweegt naar startcodon initiator tRNA bindt binding
subeenheid grote ribosomale subeenheid
Elongatie
Codonherkenning (A-site), peptidebinding (A-site), translocatie (P-site).
Terminatie
Release factor (eiwit) herkent stopcodon, peptide komt vrij, ribosomale subeenheden dissociëren. Dit proces kost energie, komt
vrij door hydrolyse van GTP.
Recombinant DNA technologie (combineren verschillende DNA moleculen).
1. DNA geknipt met restrictie enzymen.
2. DNA geplakt in vector m.b.v. ligase
3. Vector wordt geïntroduceerde in een organisme.
Restrictie enzymen knippen DNA op specifieke herkenningssequentie (6-9 basenparen, meestal genetisch palindroom).
Afkomstig uit bacteriën als verdediging tegen vreemd DNA (eigen DNA beschermd door methylatie).
Na knippen hebben de fragmenten ‘blunt ends' (recht geknipt, geen stukje uitstekende streng) of 'sticky ends' ook wel 'cohesive
ends’. Na digestie kunnen ‘cohesive ends' H-bruggen vormen met bijv. een plasmide (recombinant DNA) daarvoor moeten ze
wel geknipt zijn door hetzelfde restrictie enzym.
Plasmiden (6-12 kb) Makkelijk geïsoleerd & ingebracht. Geoptimaliseerd door mens voor kloneren. Expressie
vector : plasmide/virus voor genexpressie in cellen
Bacteriofagen (35 kb) DNA geïnjecteerd, meegenomen in de replicatiecylcus
Cosmide (45 kb) Plasmide met cos site (herkenningssite op virus-DNA voor assembleren virus deeltjes), ook
ingepakt in eiwitmantel gebruikt om cellen te infecteren. Het DNA wordt geïnjecteerd
maar gedraagt zich daarna als een normale plasmide.
Bacterial artificial chromosomes Genetisch gemodificeerde F-plasmiden ongeschikt on eiwitten tot expressie te brengen
(BACs) (300 kb)
Yeast artificial chromosomes Genetische gemodificeerde genomen die in gist repliceren
(YACs) (200-2000 kb)
VECTOREN
Niveaus van het reguleren van eiwitproductie:
- Chromatine modificatie
- Transcriptie regulatie
- Post-transcriptionele regulatie; alternatieve splicing
2
, - RNA interferentie
- Regulatie op niveau van eiwit (fosforylatie/defosforylatie)
Eiwitten herkennen breuk, ontwinden
de DNA helix. Ze breken aan de 5’ kant
een (deel van) een streng af (end
processing) enkelstrengs 3’uiteinde.
Strand invasion vindt plaats; het
enkelstrengs DNA gaat basenparen met
een complementaire streng van een
ander homoloog DNA molecuul (bv
tweede exemplaar van chromosoom).
Dit gaat vaak fout omdat er nucleotiden
ontbreken en er een deletie kan ontstaan. DNA polymerase kan dan weer gaan
aanbouwen. Er ontstaat een kruisvormige structuur, een holliday junction. Deze holliday
junctions worden geknipt
Als laatste volgt ligatie (resolution).
CRISPR als immuunsysteem
1. Herkenning & afbraak vreemd viraal DNA
2. Inbouw vreemd DNA als spacer in CRISPR gebied
3. Spacer en CRISPR DNA wordt afgeschreven naar crRNA
4. crRNA bindt tracrRNA
5. tracrRNA bindt met crRNA aan Cas9 eiwit
6. Cas9crRNA complex knipt DNA sequenties die (1) overeenkomen met crRNA én (2) daarvoor een PAM sequentie
bevatten.
3 toepassingen CRISPR:
Vaccinatie functionele bacteriën
Evolutionair onderzoek bacteriën
Genome editing.
Wij hebben guide RNA (gRNA) gemaakt, samengesteld van crRNA (dat complementair is aan het gen dat je wil aanpassen), en
tracrRNA (dat een complex vormt met het Cas9 eiwit).
Je kan Cas9 en gRNA op verschillende manieren introduceren in een cel:
1. Cas9 DNA & gRNA DNA
2. Cas9 mRNA & gRNA.
3. Cas9 eiwit & gRNA
CRISPR als gene editing techniek:
uitschakelen van een specifiek gen
gRNA (net crRNA deel complementair aan specifiek gen) en Cas9 eiwit.
Als het crRNA complementair is, en er een PAM sequentie aanwezig is, kan Cas9 knippen op deze specifieke locatie. DNA kan
hersteld worden door non-homologues end joining, maar dit kan leiden tot deleties. Zo introduceer je op een specifieke plek een
Mutatie.
Introduceren van een sequentie →
gRNA (met crRNA complementair aan specifieke locatie), Cas9 eiwit en DNA fragment (met homologe domeinen aan specifieke
locatie).
Als het crRNA complementair is, en er een PAM sequentie aanwezig, knipt Cas9. De Knip wordt hersteld door homologe
recombinatie met het DNA fragment.
Voordelen CRISPR :
3
