SMV ONCOLOGY DT2
Ch. 7 Apoptosis
Introduction
Apoptose is de gereguleerde en geordende destructie van een cel door een genetisch
gecodeerd proces, ook wel genaamd programmed cell death (PCD). Dit proces is erg netjes
en laat bijna geen bewijs achter dat deze cel heeft bestaan, waardoor er geen inductie of
inflammatie plaatsvindt. De apoptotic bodies worden opgenomen tijdens fagocytose door
macrofagen en in de buurt liggende cellen. Deze bodies worden herkend door deze cellen
door het eiwit phosphatidyl serine die eerst aan de binnenkant van het membraan zat, maar
is geflipflopt naar de buitenkant tijdens apoptose.
Apoptose is een ATP afhankelijk proces en heeft vele functies:
- Ontwikkeling morfogenese: krijgen van een vorm tijdens embryogenese.
- Reguleren van celaantallen.
- Verwijderen van beschadigde cellen.
- Negatieve en positieve selectie van lymfocyten.
- Cytotoxisch effect van radio- en chemotherapie. Induceren celdood via apoptose.
In een mens ondergaan 2,2 kg aan cellen apoptose per dag, dit is erg veel.
Necrose is een andere vorm van celdood, verschillen met apoptose:
Apoptose is sterk gereguleerd, inductie door signalering van verschillende triggers:
- Verlies van groeifactoren of adhesie.
- Death receptoren van de TNFR familie.
- T- en B-cel antigen receptoren.
- Cytotoxische T-lymfocyten (CTLs).
- DNA schade: radiatie en chemotherapie.
- Stress condities, zoals metabolische stress of redox radicalen.
Als apoptose is geïnduceerd zullen er veranderingen plaatsvinden in de mitochondria. Dit zal
leiden tot activatie van de caspase familie en vervolgens proteolytische cleavage van
structuur en functionele eiwitten. Dit zorgt voor de apoptose morfologie.
Caspases
Caspases zijn cysteine-proteases en tyoe 2, 3, 6, 7, 8, 9 en 10 zijn de machinery van
apoptose. Ze zijn aanwezig in de cel als pro-vormen en zijn verdeeld in:
- Initiators: 2, 8, 9 en 10.
- Effectors: 3, 6 en 7.
, - Inflammatory: 1, 4 en 5. Betrokken bij neurodegeneratieve aandoeningen
Caspases worden geactiveerd in twee stappen: eerst
gedeeltelijk processed, dan volledig. Caspases bevatten een
prodomein links, een groot en een klein subunit domein die
worden verbonden door een spacer. Het grote subunit
domein heeft een specifieke aminozuursequentie die verschilt
per caspase. Deze worden gebruikt voor activatie. Als eerst
worden het kleine subunit domein gebonden aan de grote en
daarna wordt het pro domein verwijderd.
Apoptosis pathways
Er zijn in totaal vier apoptose pathways geïdentificeerd: intrinsieke pathway, extrinsieke
pathway, granzyme B gemedieerde pathway en de ER gemedieerde pathway. De twee
grootste zijn de intrinsieke en extrinsieke pathway. De extrinsieke pathway wordt getriggerd
door een death ligand die bindt aan zijn receptor. De intrinsieke pathway wordt getriggerd
door UV, radiatie, oncogenen, DNA schade, etc, stress in de cel zelf.
Caspase 3, 6, en/of 7 herkennen en cleaven allerlei eiwitten in de cel, de meeste eiwitten
zijn essentieel voor de cel. Dit zorgt voor het afmaken van het apoptose proces.
Extrinsic apoptosis pathway
Fas ligand bindt aan de fas receptor, waardoor deze trimeriseert met twee andere fas
gebonden fas receptoren. Hierdoor kan FADD binden met zijn death domein aan het death
domein van de receptoren. Hierdoor wordt pro-caspase 8 geworven die bindt met zijn death
effector domein aan FADD zijn death effector domein, vormen samen het death inducing
signalling complex. Caspase 8 wordt geactiveerd wat zal leiden tot de caspase cascade en
uiteindelijk het cleaven van de target eiwitten. Naast de fas receptor kan ook de TNF
receptor worden geïnduceerd door TNF. Deze gebruikt TRADD in plaats van FADD als
adaptor eiwit, voor de rest is hij hetzelfde als de Fas pathway.
Er bestaan twee deocy receptoren voor death ligands die geen intracellulair domein
bevatten en dus geen signaal kunnen doorgeven in de cel.
Intrinsic apoptosis pathway
Intracellulaire stress signalen leiden tot de translocatie van Bax en Bac in het mitochondriaal
membraan als een tunnel. Hierdoor kan cytochrome-c zich buiten het mitochondrium
verplaatsen en die het apoptosoom vormt samen met Apaf-1 en pro-caspase 9. Caspase 9
is nu geactiveerd waardoor de caspase cascade verder gaat. Dit gebeurt alleen in de
aanwezigheid van ATP.
Regulators of the apoptosis pathway
Je hebt verschillende apoptose regulatoren die op verschillende stappen van het proces
kunnen inspelen.
Bcl-2 familie
Bcl-2 reguleert de intrinsieke apoptose pathway door het reguleren van de mitochondriale
permeabiliteit. Het is een grote familie aan eiwitten met een Bcl-2 homoloog domein.
,Hierdoor kunnen ze hetero of homodimeren vormen door ene gedeeld domein (BH3). De
familie kan worden onderscheiden in drie groepen: anti-apoptotisch, pro-apoptotisch en BH3
only. BH3 is ook pro-apoptotisch.
Er zit een balans tussen de eiwitten van de Bcl-2 familie. De anti-apoptotische eiwitten
binden normaal de pro-apoptotische zoals Bac en Bax met hun BH3 domein. Hierdoor is het
mitochondrium niet permeabel en vindt er geen apoptose plaats. Als de BH3 only eiwitten
binden aan de anti-apoptotische eiwitten, komen de pro-apoptotische vrij en kan inductie van
apoptose plaatsvinden. Verschillende anti-apoptotische eiwitten binden aan verschillende
pro-apoptotische eiwitten.
c-Flip
c-Flip is een extrinsieke apoptose inhibitor en er zijn twee vormen: short en long. c-Flip short
lijkt op caspase 8, maar heeft geen domein die de caspase cascade triggert. Voor activatie
moeten twee pro-caspases 8 dimeriseren, maar als hij dimeriseert met c-Flip zal dit
resulteren in geen activiteit. Bij c-Flip long is het nog onbekend of het een inhibitor of een
inducer van apoptose is.
IAPs
IAPs inhiberen downstream apoptose eiwitten.
IAP familieleden hebben BIR domeinen. Er zijn
verschillende subklassen: plaatje hiernaast.
De intrinsieke en extrinsieke pathway zijn met
elkaar verbonden door het Bid eiwit. Als
caspase 8 wordt geactiveerd door de
extrinsieke pathway kan deze het Bid eiwit
cleaven. Dit leidt tot inductie van caspase 9.
p53
p53 induceert apoptose in respons op DNA
schade en cellulaire stress. Hij heeft twee soorten pathways: transcriptie-
dependent en -independent. Bij dependent induceert p53 de transcriptie
van death receptor genen en de pro Bcl-2 familie en onderdrukt de
transcriptie van anti Bcl-2 familie. Ook zorgt hij voor upregulatie van de
modulator van apoptose: PUMA. Bij independent activeert p53 Bax in het
cytoplasma.
Detection of apoptosis
Technieken die je kunt gebruiken voor het detecteren van apoptose:
- Morfologie bekijken met fluorescentie of immunohistochemistry (staining).
- DNA schade onderzoeken, dit is echter niet specifiek voor apoptose.
, - Functionele viability onderzoeken.
- RT-PCR, NGS.
- Caspase activatie: western blot, immunohistochemistry, FACS analyse en
fluorescentie analyse.
Apoptosis and cancer
Het onderdrukken van celdood is een hallmark van kanker. In kanker is de trigger voor
apoptose er wel, maar is de activatie van caspases is op een bepaalde manier geblokkeerd.
Dit kan op een heleboel manieren, bijvoorbeeld door hoge expressie van XIAP een anti-
apoptotisch eiwit die activatie van caspase 3 blokkeerd.
Preventie van apoptose in kankercellen:
- Mutaties in apoptose regulatie genen.
- Inhibitie van pro-apoptotische genen en eiwitten.
- Upregulatie van anti-apoptotische genen en eiwitten, dit is vaak het geval.
Vaak zitten de mutaties in de intrinsieke pathway:
- p53 mutaties: solide tumoren, leukemie, lymphoma.
- Apaf-1: epigenetische inactivatie, metastatic melanoma.
- Bcl-2: translocatie/amplificatie, follicular lymphoma, diffuse large B-cel lymphoma.
- Bax: mutatie, colontumoren.
- XIAP: upregulatie, leukemie, lymphomas, longkanker en prostaatkanker.
- Survivin: upregulatie, hoofd en nekkanker.
Er zijn minder mutaties in de extrinsieke pathway. Als ze er zijn dan zijn het mutaties in de
fas receptor en mutatie/epigenetisch verlies van caspase 8 en 10. c-Flip is een inhibitor die
we zien in sommige tumoren, maar meestal is er een hoge expressie van Bcl-2.
Solide tumoren worden verwijderd door operaties, maar bij systemische tumoren worden ze
vaker behandeld met apoptose-inducerende chemotherapie. Echter kan kanker ook resistent
worden voor chemotherapie door inhibite van apoptotische pathways: mutaties in p53,
upregulatie van anti Bcl-2/IAP en downregulatie van pro Bcl-2.
Apoptose-gebaseerde therapieën:
- Gebruik van apoptotische eiwitten als makers voor diagnostische en prognostische
doeleinden in tumor biopsies.
- Gerationaliseerde therapieën: targeten moleculaire mechanismes door het activeren
van pro-apoptotische factoren en het onderdrukken van anti-apoptotische factoren.
Dit wordt gedaan door 1 farmacon of een combinatie van meerdere.
- Experimentele strategie: stimuleren van apoptose en inhiberen van anti-apoptotische
blokkades in tumorcellen.
- Novel targeted strategieën: kleine moleculen gebruiken voor induceren apoptose.
Ch. 7 Apoptosis
Introduction
Apoptose is de gereguleerde en geordende destructie van een cel door een genetisch
gecodeerd proces, ook wel genaamd programmed cell death (PCD). Dit proces is erg netjes
en laat bijna geen bewijs achter dat deze cel heeft bestaan, waardoor er geen inductie of
inflammatie plaatsvindt. De apoptotic bodies worden opgenomen tijdens fagocytose door
macrofagen en in de buurt liggende cellen. Deze bodies worden herkend door deze cellen
door het eiwit phosphatidyl serine die eerst aan de binnenkant van het membraan zat, maar
is geflipflopt naar de buitenkant tijdens apoptose.
Apoptose is een ATP afhankelijk proces en heeft vele functies:
- Ontwikkeling morfogenese: krijgen van een vorm tijdens embryogenese.
- Reguleren van celaantallen.
- Verwijderen van beschadigde cellen.
- Negatieve en positieve selectie van lymfocyten.
- Cytotoxisch effect van radio- en chemotherapie. Induceren celdood via apoptose.
In een mens ondergaan 2,2 kg aan cellen apoptose per dag, dit is erg veel.
Necrose is een andere vorm van celdood, verschillen met apoptose:
Apoptose is sterk gereguleerd, inductie door signalering van verschillende triggers:
- Verlies van groeifactoren of adhesie.
- Death receptoren van de TNFR familie.
- T- en B-cel antigen receptoren.
- Cytotoxische T-lymfocyten (CTLs).
- DNA schade: radiatie en chemotherapie.
- Stress condities, zoals metabolische stress of redox radicalen.
Als apoptose is geïnduceerd zullen er veranderingen plaatsvinden in de mitochondria. Dit zal
leiden tot activatie van de caspase familie en vervolgens proteolytische cleavage van
structuur en functionele eiwitten. Dit zorgt voor de apoptose morfologie.
Caspases
Caspases zijn cysteine-proteases en tyoe 2, 3, 6, 7, 8, 9 en 10 zijn de machinery van
apoptose. Ze zijn aanwezig in de cel als pro-vormen en zijn verdeeld in:
- Initiators: 2, 8, 9 en 10.
- Effectors: 3, 6 en 7.
, - Inflammatory: 1, 4 en 5. Betrokken bij neurodegeneratieve aandoeningen
Caspases worden geactiveerd in twee stappen: eerst
gedeeltelijk processed, dan volledig. Caspases bevatten een
prodomein links, een groot en een klein subunit domein die
worden verbonden door een spacer. Het grote subunit
domein heeft een specifieke aminozuursequentie die verschilt
per caspase. Deze worden gebruikt voor activatie. Als eerst
worden het kleine subunit domein gebonden aan de grote en
daarna wordt het pro domein verwijderd.
Apoptosis pathways
Er zijn in totaal vier apoptose pathways geïdentificeerd: intrinsieke pathway, extrinsieke
pathway, granzyme B gemedieerde pathway en de ER gemedieerde pathway. De twee
grootste zijn de intrinsieke en extrinsieke pathway. De extrinsieke pathway wordt getriggerd
door een death ligand die bindt aan zijn receptor. De intrinsieke pathway wordt getriggerd
door UV, radiatie, oncogenen, DNA schade, etc, stress in de cel zelf.
Caspase 3, 6, en/of 7 herkennen en cleaven allerlei eiwitten in de cel, de meeste eiwitten
zijn essentieel voor de cel. Dit zorgt voor het afmaken van het apoptose proces.
Extrinsic apoptosis pathway
Fas ligand bindt aan de fas receptor, waardoor deze trimeriseert met twee andere fas
gebonden fas receptoren. Hierdoor kan FADD binden met zijn death domein aan het death
domein van de receptoren. Hierdoor wordt pro-caspase 8 geworven die bindt met zijn death
effector domein aan FADD zijn death effector domein, vormen samen het death inducing
signalling complex. Caspase 8 wordt geactiveerd wat zal leiden tot de caspase cascade en
uiteindelijk het cleaven van de target eiwitten. Naast de fas receptor kan ook de TNF
receptor worden geïnduceerd door TNF. Deze gebruikt TRADD in plaats van FADD als
adaptor eiwit, voor de rest is hij hetzelfde als de Fas pathway.
Er bestaan twee deocy receptoren voor death ligands die geen intracellulair domein
bevatten en dus geen signaal kunnen doorgeven in de cel.
Intrinsic apoptosis pathway
Intracellulaire stress signalen leiden tot de translocatie van Bax en Bac in het mitochondriaal
membraan als een tunnel. Hierdoor kan cytochrome-c zich buiten het mitochondrium
verplaatsen en die het apoptosoom vormt samen met Apaf-1 en pro-caspase 9. Caspase 9
is nu geactiveerd waardoor de caspase cascade verder gaat. Dit gebeurt alleen in de
aanwezigheid van ATP.
Regulators of the apoptosis pathway
Je hebt verschillende apoptose regulatoren die op verschillende stappen van het proces
kunnen inspelen.
Bcl-2 familie
Bcl-2 reguleert de intrinsieke apoptose pathway door het reguleren van de mitochondriale
permeabiliteit. Het is een grote familie aan eiwitten met een Bcl-2 homoloog domein.
,Hierdoor kunnen ze hetero of homodimeren vormen door ene gedeeld domein (BH3). De
familie kan worden onderscheiden in drie groepen: anti-apoptotisch, pro-apoptotisch en BH3
only. BH3 is ook pro-apoptotisch.
Er zit een balans tussen de eiwitten van de Bcl-2 familie. De anti-apoptotische eiwitten
binden normaal de pro-apoptotische zoals Bac en Bax met hun BH3 domein. Hierdoor is het
mitochondrium niet permeabel en vindt er geen apoptose plaats. Als de BH3 only eiwitten
binden aan de anti-apoptotische eiwitten, komen de pro-apoptotische vrij en kan inductie van
apoptose plaatsvinden. Verschillende anti-apoptotische eiwitten binden aan verschillende
pro-apoptotische eiwitten.
c-Flip
c-Flip is een extrinsieke apoptose inhibitor en er zijn twee vormen: short en long. c-Flip short
lijkt op caspase 8, maar heeft geen domein die de caspase cascade triggert. Voor activatie
moeten twee pro-caspases 8 dimeriseren, maar als hij dimeriseert met c-Flip zal dit
resulteren in geen activiteit. Bij c-Flip long is het nog onbekend of het een inhibitor of een
inducer van apoptose is.
IAPs
IAPs inhiberen downstream apoptose eiwitten.
IAP familieleden hebben BIR domeinen. Er zijn
verschillende subklassen: plaatje hiernaast.
De intrinsieke en extrinsieke pathway zijn met
elkaar verbonden door het Bid eiwit. Als
caspase 8 wordt geactiveerd door de
extrinsieke pathway kan deze het Bid eiwit
cleaven. Dit leidt tot inductie van caspase 9.
p53
p53 induceert apoptose in respons op DNA
schade en cellulaire stress. Hij heeft twee soorten pathways: transcriptie-
dependent en -independent. Bij dependent induceert p53 de transcriptie
van death receptor genen en de pro Bcl-2 familie en onderdrukt de
transcriptie van anti Bcl-2 familie. Ook zorgt hij voor upregulatie van de
modulator van apoptose: PUMA. Bij independent activeert p53 Bax in het
cytoplasma.
Detection of apoptosis
Technieken die je kunt gebruiken voor het detecteren van apoptose:
- Morfologie bekijken met fluorescentie of immunohistochemistry (staining).
- DNA schade onderzoeken, dit is echter niet specifiek voor apoptose.
, - Functionele viability onderzoeken.
- RT-PCR, NGS.
- Caspase activatie: western blot, immunohistochemistry, FACS analyse en
fluorescentie analyse.
Apoptosis and cancer
Het onderdrukken van celdood is een hallmark van kanker. In kanker is de trigger voor
apoptose er wel, maar is de activatie van caspases is op een bepaalde manier geblokkeerd.
Dit kan op een heleboel manieren, bijvoorbeeld door hoge expressie van XIAP een anti-
apoptotisch eiwit die activatie van caspase 3 blokkeerd.
Preventie van apoptose in kankercellen:
- Mutaties in apoptose regulatie genen.
- Inhibitie van pro-apoptotische genen en eiwitten.
- Upregulatie van anti-apoptotische genen en eiwitten, dit is vaak het geval.
Vaak zitten de mutaties in de intrinsieke pathway:
- p53 mutaties: solide tumoren, leukemie, lymphoma.
- Apaf-1: epigenetische inactivatie, metastatic melanoma.
- Bcl-2: translocatie/amplificatie, follicular lymphoma, diffuse large B-cel lymphoma.
- Bax: mutatie, colontumoren.
- XIAP: upregulatie, leukemie, lymphomas, longkanker en prostaatkanker.
- Survivin: upregulatie, hoofd en nekkanker.
Er zijn minder mutaties in de extrinsieke pathway. Als ze er zijn dan zijn het mutaties in de
fas receptor en mutatie/epigenetisch verlies van caspase 8 en 10. c-Flip is een inhibitor die
we zien in sommige tumoren, maar meestal is er een hoge expressie van Bcl-2.
Solide tumoren worden verwijderd door operaties, maar bij systemische tumoren worden ze
vaker behandeld met apoptose-inducerende chemotherapie. Echter kan kanker ook resistent
worden voor chemotherapie door inhibite van apoptotische pathways: mutaties in p53,
upregulatie van anti Bcl-2/IAP en downregulatie van pro Bcl-2.
Apoptose-gebaseerde therapieën:
- Gebruik van apoptotische eiwitten als makers voor diagnostische en prognostische
doeleinden in tumor biopsies.
- Gerationaliseerde therapieën: targeten moleculaire mechanismes door het activeren
van pro-apoptotische factoren en het onderdrukken van anti-apoptotische factoren.
Dit wordt gedaan door 1 farmacon of een combinatie van meerdere.
- Experimentele strategie: stimuleren van apoptose en inhiberen van anti-apoptotische
blokkades in tumorcellen.
- Novel targeted strategieën: kleine moleculen gebruiken voor induceren apoptose.
