Samenvatting thema 1 molbio

MOLECULAIRE BIOLOGIE
THEMA 1: DNA REPLICATIE & MOLECULAIR
KLONEREN.
HERHALING DNA/RNA
De DNA streng lees je van 3’ (OH-groep)  5’ (fosfaatgroep). Het heeft als basis
deoxyribose. Het verschil tussen een nucleotide en een nucleoside is wel of geen
fosfaatgroep. Slechts 1,5% van het humane genoom codeert voor eiwitten.
Genen kunnen namelijk ook voor RNA moleculen coderen die geen eiwitten
produceren. De niet-coderende DNA sequenties tussen genen heten intergenic
sequences en de niet-coderende DNA sequenties binnen genen heten introns.
RNA: enkelstrengs, ribose en uracil.

Prokaryoten (zonder kern) zijn klein, bevatten geen organellen, hebben een
hogere gendichtheid met circulair genomisch materiaal. Hieronder vallen
bacteriën. Eukaryoten (met kern) zijn groot, bevatten wel organellen, hebben een
lagere gendichtheid met lineair genomisch materiaal (chromosomen). Hieronder
valt de mens en gist.

MOLECULAIR KLONEREN
1. ISOLEREN VAN GENOMISCH DNA / RNA
Je kunt DNA krijgen door middel van het fractioneren van het weefsel.

2. PCR OP GENE OF INTEREST
PCR is een methode om een specifiek stuk DNA te amplificeren. DNA
polymerasen hebben primers nodig als begin. De primers zitten vast aan het
nieuwe stukje DNA en worden dus niet opnieuw gebruikt. Het ontwerp van een
primerpaar (Forward en Reverse) vindt plaats op de bekende sequentie. Primers
geven de PCR een grote specificiteit (als ze lang genoeg zijn). Voor de reactiemix
is DNA met target sequentie nodig met een primerpaar, DNA polymerase,
voldoende nucleotiden (ook wel dNTPs) en een reactiebuffer (met MgCl2 of
MnCl2). De drie stappen:

1. Denaturatie: dubbelstrengs DNA uit elkaar halen, bij 94 graden Celsius
gedurende 30 sec.
2. Annealing/hybridisatie: primers gaan op DNA plakken, bij 50-60 graden
Celsius. De ideale temperatuur wordt bepaald door de optimale
temperatuur van de primer. Als ie te laag is, blijft de primer zitten op
plekken waar het niet hoort en wordt de reactie minder specifiek 
aspecifieke producten. Als ie te hoog is, kunnen de primers niet blijven
plakken, omdat alle waterstofbruggen worden verbroken.

, 3. Elongatie: het verlengen van DNA streng waardoor er weer twee
dubbelstrengse ontstaan, bij 72 graden Celsius. Dit is afhankelijk van hoe
lang je enzym en gen is.




De smelttemperatuur (Tm): is
de temperatuur waarbij een primer loslaat van zijn template. De vuistregel
hiervoor is: Tm = 4(G + C) + 2(A + T)

De annealingtemperatuur (Ta): is de temperatuur waarbij men primers laat
hechten aan de template. De richtlijnen:

o Lengte: 17 – 28 nucleotiden. Als het langer is, wordt de annealing
moeilijker en korter wordt de specificiteit minder.
o GC-gehalte: tussen 50-60%. Bij een hoger gehalte krijg je een te hoge
smelttemperatuur en lager wordt de specificiteit minder.
o Forward en reverse primers moeten ongeveer dezelfde smelttemperatuur
hebben (binnen 5 graden Celsius). Zo kunnen ze tegelijk van start gaan.
o Primers moeten aan 3’ zijde eindigen op G or C → voorkomt loslaten.
o Niet méér dan drie C’s of G’s aan 3’ uiteinde → primer bindt dan te
makkelijk aan (verkeerde) G of C rijke gebieden in het target DNA.
o Er mag géén baseparing mogelijk zijn in de primer zelf (Self-annealing) of
tussen de twee
primers (primer-
dimer).




3. DIGESTIE VAN GEN EN PLASMIDE
Om een stuk recombinant DNA te maken, begin je
met een stuk circulair ds plasmide DNA. Deze maak je
open met een nuclease. In dit opengebroken stukje
zet je vervolgens het DNA fragment wat gecloned
moet worden. De bacteriestammen hebben unieke
restrictie enzymen door een unieke combinatie van de