Lesson 1
Concept 1.1 Ethiek in het algemeen
Een paar verschillende soorten ethiek:
Descriptieve ethiek: beschrijft én bestudeert moraal zonder zelf een moreel standpunt in te nemen
Meta-ethiek: vergelijkt diverse moralen m.b.t. ethische begrippen en waar ze vandaan komen. Is er
een universeel ethisch systeem mogelijk?
Normatieve ethiek: formuleert morele basisprincipes en maatstaven. Ontwikkelt theorieën die
voorschrijven welke handelingen van de mens goed of fout zijn
Toegepaste ethiek: het gaat hier om de studie van specifieke problemen met gebruik of toepassing
Even inzoomen op normatieve ethiek
Praktische filosofie die zich bezighoudt met wat goed en fout is moraal filosofie/ zedenleer
Ethiek of moraalwetenschap
Houdt zich bezig met de kritische bezinning over het juiste handelen
Probeert vast te stellen hoe te beoordelen of een handeling goed of fout is én onderzoekt de
motieven en consequenties van deze handeling
Bestudeert moraal en stelt daar vragen over
Geen beoordeling maar de redenering erachter
Ethiek is daarom gekoppeld aan de toetsing en correctie van menselijk handelen
Wat zijn normen en waarden?
Moraal: totaal aan opvattingen over goed en kwaad bij een groep, individu, samenleving
Bestaat uit normen en waarden
Is een onderdeel van levensbeschouwing
Normen: manieren van handelen die nageleefd moeten worden
Waarden: zaken/ ideeën die mensen belangrijk vinden en daarom nastreven
Hoofdstroming I binnen de normatieve ethiek - Deontologische ethiek
Plicht, gaat uit van absolute gedragsregels, vaak niet gesteld als normen
Een daad kan goed bedoeld zijn, ondanks eventuele slechte gevolgen. Het gaat om het motief
Universele regels, religieuze wetten e persoonlijke of culturele waarden
Categorisch imperatief (Immanuel Kant): ‘’Richt je doen en laten uitsluitend naar gedragregels
waarvan je zou kunnen willen dat iedereen zich ernaar richt’’
Divine command theory: een actie is goed wanneer het door goed als goed wordt gezien
Hoofdstroming II binnen de normatieve ethiek - Teleologische ethiek
Doel, moraal in dienst van een ‘hoger doel’ zoals maatschappelijk nut
Gevolgen ethiek/ consequentialisme (Jeremy Bentham): gevolgen bepalen het moreel oordeel over
een handeling, ‘’Doel heiligt de middelen’’
Gevolgen voor de samenleving (zo veel mogelijk goed en zo weinig mogelijk kwaad)
Deugdethiek (Aristoteles): karakter van handelend persoon staat centraal bij moreel oordelen.
Deugden als leidraad voor leven, zoals geluk, wijsheid, rechtvaardigheid, moed, etc.
Keerzijde: teveel van het goede vormt een valkuil
,Hoofdstroming III binnen de normatieve ethiek - Zorgethiek
Zorg van mensen voor elkaar staat hier centraal
Ethiek behorende bij het welzijnswerk
Van oorsprong meer feministische kritiek op klassieke morele theorieën (te strak en te afstandelijk)
Vaak onderdeel van de opleiding, bijscholing en het werk van werkers in de zorg
Concept 1.2 Toegepaste ethiek
Het gaat hier om de studie van specifieke problemen met gebruik of toepassing
Bio-ethiek: ethische aspecten van menselijk ingrepen in het menselijk leven en het leven van planten
en dieren, zoals genetische manipulatie
Beroepsethiek: principes en regels die betrekking hebben op het professioneel handelen, zoals
beroepcodes en gedragscodes, maar ook ongeschreven regels voor het beroepsmatig handelen
(zoals; diplomering en machtsverhoudingen onderling en tussen zorgvragen en zorgverlener)
Milieuethiek: morele relaties van de mens met zijn natuurlijke omgeving en op de waarde en morele
status van die omgeving met haar niet-humane bewoners zelf
Stappenplan: Eische Toolkit
Inventariseer de vragen en probeer daar een antwoord op te vinden (beeld van de situatie)
Gy
Formuleer de morele vraag waar je antwoord op wilt hebben
Verkennen
Breng in kaart wie er allemaal bij de situatie betrokken zijn, 0
wat ieders verantwoordelijkheid is en welke argumenten Evalueren Formuleren
de betrokkenen hebben
Maak een afweging van de verschillende argumenten
Neem een besluit en maak afspraken over hoe het besluit Besluiten Analyseren
genomen wordt
Afwegen
Evalueer het denkproces en gesprek met betrokkenen
, Lesson 2
Concept 2.1 Blotting methodes
Souern bloing
Wat toon je aan: DNA
Principe: na gelelektroforese worden de DNA-fragmenten overgebracht vanuit de gel of matrix naar
een vast membraan, dat vervolgens wordt blootgesteld aan een gelabeld enkelstrengs DNA fragment
(probe) van jouw favoriete gen. Door detectie van het label worden dan alleen de fragmenten zichtbaar
die overeenkomen met de probe van jouw favoriete stukje DNA
Methode:
1 Gelelektroforese
2 Week gel in HCL (hoogmoleculair DNA gaat moeilijk
door gel heen, blijft bovenin zitten & gaat lastig door
membraan heen in HCL wordt het in kleinere stukjes
gehakt waardoor het vergemakkelijkt wordt)
3 Denaturatie met NaOH (DNA enkelstrengs, de H-
bruggen trekken elkaar niet meer aan, de backbone is
negatief geladen, dus de enkelstrengs stoten elkaar af)
H Neutralisatie met hoge zout buffer (voorkomt binding
aan de gel)
5
Transfer van DNA naar membraan (m.b.v. papiertjes)
6 Voeg enkelstrengs gelabeld DNA/RNA toe (probe)
7
Incuberen (bij geschikte temperatuur & ion-sterkte)
0 Alle ongebonden probe wegwassen
I Detecteer de hybride probe-target sequentie
Norern bloing
Wat toon je aan: RNA
Principe: na gelelektroforese worden de RNA-fragmenten overgebracht vanuit de gel of matrix naar
een vast membraan, dat vervolgens wordt blootgesteld aan een gelabeld enkelstrengs DNA fragment
(probe) van jouw favoriete gen. Door detectie van het label worden dan alleen de fragmenten zichtbaar
die complementaire sequenties bevatten met de probe sequentie van jouw favoriete stukje RNA
Western bloing
Wat toon je aan: eiwit
Principe: na gelelektroforese worden de eiwit-fragmenten overgebracht vanuit de gel of matrix naar
een vast membraan, dat vervolgens wordt blootgesteld aan een antilichaam dat specifiek is voor jouw
target eiwit. Binding van het antilichaam wordt gedetecteerd m.b.v. een radioactief of chemische tag
Membranes
PVDF: voor eiwit (Western blotting), hogere bindingscapaciteit dan Nitrocellulose
Hybond N : voor DNA & RNA (Nylon is positief geladen en DNA negatief, waardoor hij goed blijft
plakken is een voordeel, is ook hitte en chemisch resistant)
,Capiaire bloing Gewicht
Blotting: immobiliseren van nucleïnezuren op een vaste
-T
ondergrond/ drager
Is geschikt voor alle groottes DNA, alle gelen alleen duurt 6-24 h
De transfer buffer wordt opgezogen door de stapel filtreerpapier Membraan
zodat het DNA vanaf de gel geelueerd wordt naar een membraan.
Boven op de filtreerpapiertjes wordt een gewicht geplaatst zodat Gel
er een goede connectie is tussen de verschillende lagen van het
-
transfer system. Buffer
(Semi-)Dry bloing
Blotting papier en het membraan worden van tevoren nat gemaakt (opbouw: anode, papier, membraan,
gel, papier, cathode)
Snelle transfer:
DNA: 10 min
RNA: 30-35 min
Als het te heet wordt, smelt je agarose gel dus let op bij het instellen!
Je DNA moet klein genoeg zijn om door de gel heen te komen DNA depurineren om te
fragmenteren
Als laatste fixeren om de nucleïnezuren permanent te laten binden aan het membraan door middel van
crosslinks. Dit is gemakkelijk uit te voeren in de magnetron!
Concept 2.2 Labeling methodes
Polymerase I
Functie in replicatie en reparatie van DNA, wordt ook gebruikt bij het maken van probes
Activiteiten:
5’ - 3’ DNA-dependent DNA polymerase, voegt nucleotides toe aan de 3’-OH kant, maar heeft
een primer nodig als beginpunt
5’ - 3’ exonuclease (nick translation), een gaatje in de fosfaatbackbone veroorzaakt een nick
3’- 5’ exonuclease (proofreading), haalt de fouten eruit
5’ - 3’ RNA-dependent DNA polymerase
DNA 5’ End labeling
T4 polynucleotide kinase katalyseert de verwisseling van Pi van ATP
5’ ->
naar de 5’-OH ternminus van polynucleotides. Kinase fosforliseerd =
-I 5’
koppelt een radioactief fosfaat toe
DNA 3’ End labeling
Terminal transferase (TdT): template independent polymerase. Toevoeging
van deoxynucleotides aan de 3’-OH terminus van DNA moleculen. -I 3’
Nadeel: doordat er een zich een probe bevindt aan het 3’-eind, is -
verlenging door PCR niet mogelijk, want hij heeft geen vrije OH-groep
meer!
Single Nucleotide Terminator labeling
Terminator DNA polymerase, de opname van een enkele base of dideoxy -
en acylclonucleotides -
,Nick translation
Nick
De nick veroorzaakt een vrije 3’-OH, waardoor DNA polymerase I de DNA
streng kan verlengen. Hij verwijderd daarbij de nucleotide in de synthese -
richting door 5’ - 3’ exonuclease activiteit -
De nick is random, daarom is het handig als je template helemaal zuiver is
Primers
Random priming -
Klenow subunit of DNA polymerase: beschikt over 5’ 3’ polymerase -
activiteit en 3’ 5’ exonuclease (proofreading) activiteit, maar mist -
5’ 3’ exonuclease activiteit -
Concept 2.3 Probes label types
Isotopic labeling: (radioactief) wordt gedetecteerd door blootstelling aan X-ray
Voorbeelden radioactief label: P, P, S of H
32 3335 3
Non-isotopic labeling (niet radioactief) omvat:
Direct labeling: m.b.v. gemodificeerde nucleotiden die een fluorfoor bevatten
Indirect labeling: m.b.v. een reportermolecuul gehecht aan een nucleotideprecursor. Veel gebruikte
methode zijn; Biotine-Streptavidine en Digoxigenine (DIG)
Voorbeelden niet-radioactief label: Broom, DIG, Biotine en fluorescente moleculen
Concept 2.4 Principe en factoren bij hybridisatie
Smelt temperatuur
Tm: de temperatuur waarbij 50% van een DNA sequentie gehybridiseerd is met zijn complementaire
streng
Tm van een dsDNA moleculen langer dan 50 nucleotiden lang is afhankelijk van:
Lengte in bp
GC content (hoe maar GC, hoe hoger de Tm)
Zout concentratie
Formamide concentratie
Hybridisatie buffer componenten
NaCl: Na is positief geladen en schermt de negatieve lading van de suikerfosfaat backbone af,
waardoor de probe kan annealen met het gebonden DNA. Hoe meer zout, streng wordt minder
negatief, makkelijke binding - Hoe minder zout, streng blijft negatief, moeilijke binding (negatief en
negatief stoot elkaar af en kan dus niet binden)
Detergentia en blocking agents: melkpoeder, heparine, SDS en BSA voorkomen van niet-specifieke
(hydrofobe) bindingen aan het membraan
Rate enhancers: Dextraansulfaat, Ficoll, polyvinylpyrolidon (grote hydrofiele moleculen)
vergemakkelijken de hybridisatie, waardoor de strengen elkaar beter zullen vinden & binden
Denaturants: Uream of Formamide verlagen de Tm (hybridisatie temperatuur), wanneer probe, label of
membraan niet stabiel zijn bij hoge temperaturen
, Hybridisatie stringentie
Stringentie: bindingssterkte tussen de probe en de target
Hoog/ sterk stringent: complementaire sequenties zijn niet zo’n stabiel duplex (hoge temperaturen,
lage [NaCl] en hoge denaturants)
Laag/ zwak stringent: zijn niet erg complementair en vormen een stabiel duplex (lage temperaturen,
hoge [NaCl] en lage denaturants)
Wanneer je probe lang genoegen is, kan een conventional DNA probe met een 20% mismatch toch
binden
Hybridisatie stappen
Pre-hybridisatie: membraan equilibratie en voorkomen van niet-specifieke binding
Hybridisatie, stringentie:
Temperatuur: 42 C met formamide of 65 C wanneer >16h
Heterologe probes: lagere hybridisatie temperatuur 40-55 C zonder formamide
Achtergrond (afhankelijk van blocking efficiëntie, concentratie van probe, stringentie van wassen)
Concentratie probe 10-125 ng/mL
Post-hybridisatie: was-stap om ongebonden probe te verwijderen (met de juist zoutconcentratie)
Door hoge stringentie wordt aspecifieke bindingen voorkomen mooie & zuivere bandjes,
temperatuur wordt verhoogt van 50 C naar 65 C
Concept 1.1 Ethiek in het algemeen
Een paar verschillende soorten ethiek:
Descriptieve ethiek: beschrijft én bestudeert moraal zonder zelf een moreel standpunt in te nemen
Meta-ethiek: vergelijkt diverse moralen m.b.t. ethische begrippen en waar ze vandaan komen. Is er
een universeel ethisch systeem mogelijk?
Normatieve ethiek: formuleert morele basisprincipes en maatstaven. Ontwikkelt theorieën die
voorschrijven welke handelingen van de mens goed of fout zijn
Toegepaste ethiek: het gaat hier om de studie van specifieke problemen met gebruik of toepassing
Even inzoomen op normatieve ethiek
Praktische filosofie die zich bezighoudt met wat goed en fout is moraal filosofie/ zedenleer
Ethiek of moraalwetenschap
Houdt zich bezig met de kritische bezinning over het juiste handelen
Probeert vast te stellen hoe te beoordelen of een handeling goed of fout is én onderzoekt de
motieven en consequenties van deze handeling
Bestudeert moraal en stelt daar vragen over
Geen beoordeling maar de redenering erachter
Ethiek is daarom gekoppeld aan de toetsing en correctie van menselijk handelen
Wat zijn normen en waarden?
Moraal: totaal aan opvattingen over goed en kwaad bij een groep, individu, samenleving
Bestaat uit normen en waarden
Is een onderdeel van levensbeschouwing
Normen: manieren van handelen die nageleefd moeten worden
Waarden: zaken/ ideeën die mensen belangrijk vinden en daarom nastreven
Hoofdstroming I binnen de normatieve ethiek - Deontologische ethiek
Plicht, gaat uit van absolute gedragsregels, vaak niet gesteld als normen
Een daad kan goed bedoeld zijn, ondanks eventuele slechte gevolgen. Het gaat om het motief
Universele regels, religieuze wetten e persoonlijke of culturele waarden
Categorisch imperatief (Immanuel Kant): ‘’Richt je doen en laten uitsluitend naar gedragregels
waarvan je zou kunnen willen dat iedereen zich ernaar richt’’
Divine command theory: een actie is goed wanneer het door goed als goed wordt gezien
Hoofdstroming II binnen de normatieve ethiek - Teleologische ethiek
Doel, moraal in dienst van een ‘hoger doel’ zoals maatschappelijk nut
Gevolgen ethiek/ consequentialisme (Jeremy Bentham): gevolgen bepalen het moreel oordeel over
een handeling, ‘’Doel heiligt de middelen’’
Gevolgen voor de samenleving (zo veel mogelijk goed en zo weinig mogelijk kwaad)
Deugdethiek (Aristoteles): karakter van handelend persoon staat centraal bij moreel oordelen.
Deugden als leidraad voor leven, zoals geluk, wijsheid, rechtvaardigheid, moed, etc.
Keerzijde: teveel van het goede vormt een valkuil
,Hoofdstroming III binnen de normatieve ethiek - Zorgethiek
Zorg van mensen voor elkaar staat hier centraal
Ethiek behorende bij het welzijnswerk
Van oorsprong meer feministische kritiek op klassieke morele theorieën (te strak en te afstandelijk)
Vaak onderdeel van de opleiding, bijscholing en het werk van werkers in de zorg
Concept 1.2 Toegepaste ethiek
Het gaat hier om de studie van specifieke problemen met gebruik of toepassing
Bio-ethiek: ethische aspecten van menselijk ingrepen in het menselijk leven en het leven van planten
en dieren, zoals genetische manipulatie
Beroepsethiek: principes en regels die betrekking hebben op het professioneel handelen, zoals
beroepcodes en gedragscodes, maar ook ongeschreven regels voor het beroepsmatig handelen
(zoals; diplomering en machtsverhoudingen onderling en tussen zorgvragen en zorgverlener)
Milieuethiek: morele relaties van de mens met zijn natuurlijke omgeving en op de waarde en morele
status van die omgeving met haar niet-humane bewoners zelf
Stappenplan: Eische Toolkit
Inventariseer de vragen en probeer daar een antwoord op te vinden (beeld van de situatie)
Gy
Formuleer de morele vraag waar je antwoord op wilt hebben
Verkennen
Breng in kaart wie er allemaal bij de situatie betrokken zijn, 0
wat ieders verantwoordelijkheid is en welke argumenten Evalueren Formuleren
de betrokkenen hebben
Maak een afweging van de verschillende argumenten
Neem een besluit en maak afspraken over hoe het besluit Besluiten Analyseren
genomen wordt
Afwegen
Evalueer het denkproces en gesprek met betrokkenen
, Lesson 2
Concept 2.1 Blotting methodes
Souern bloing
Wat toon je aan: DNA
Principe: na gelelektroforese worden de DNA-fragmenten overgebracht vanuit de gel of matrix naar
een vast membraan, dat vervolgens wordt blootgesteld aan een gelabeld enkelstrengs DNA fragment
(probe) van jouw favoriete gen. Door detectie van het label worden dan alleen de fragmenten zichtbaar
die overeenkomen met de probe van jouw favoriete stukje DNA
Methode:
1 Gelelektroforese
2 Week gel in HCL (hoogmoleculair DNA gaat moeilijk
door gel heen, blijft bovenin zitten & gaat lastig door
membraan heen in HCL wordt het in kleinere stukjes
gehakt waardoor het vergemakkelijkt wordt)
3 Denaturatie met NaOH (DNA enkelstrengs, de H-
bruggen trekken elkaar niet meer aan, de backbone is
negatief geladen, dus de enkelstrengs stoten elkaar af)
H Neutralisatie met hoge zout buffer (voorkomt binding
aan de gel)
5
Transfer van DNA naar membraan (m.b.v. papiertjes)
6 Voeg enkelstrengs gelabeld DNA/RNA toe (probe)
7
Incuberen (bij geschikte temperatuur & ion-sterkte)
0 Alle ongebonden probe wegwassen
I Detecteer de hybride probe-target sequentie
Norern bloing
Wat toon je aan: RNA
Principe: na gelelektroforese worden de RNA-fragmenten overgebracht vanuit de gel of matrix naar
een vast membraan, dat vervolgens wordt blootgesteld aan een gelabeld enkelstrengs DNA fragment
(probe) van jouw favoriete gen. Door detectie van het label worden dan alleen de fragmenten zichtbaar
die complementaire sequenties bevatten met de probe sequentie van jouw favoriete stukje RNA
Western bloing
Wat toon je aan: eiwit
Principe: na gelelektroforese worden de eiwit-fragmenten overgebracht vanuit de gel of matrix naar
een vast membraan, dat vervolgens wordt blootgesteld aan een antilichaam dat specifiek is voor jouw
target eiwit. Binding van het antilichaam wordt gedetecteerd m.b.v. een radioactief of chemische tag
Membranes
PVDF: voor eiwit (Western blotting), hogere bindingscapaciteit dan Nitrocellulose
Hybond N : voor DNA & RNA (Nylon is positief geladen en DNA negatief, waardoor hij goed blijft
plakken is een voordeel, is ook hitte en chemisch resistant)
,Capiaire bloing Gewicht
Blotting: immobiliseren van nucleïnezuren op een vaste
-T
ondergrond/ drager
Is geschikt voor alle groottes DNA, alle gelen alleen duurt 6-24 h
De transfer buffer wordt opgezogen door de stapel filtreerpapier Membraan
zodat het DNA vanaf de gel geelueerd wordt naar een membraan.
Boven op de filtreerpapiertjes wordt een gewicht geplaatst zodat Gel
er een goede connectie is tussen de verschillende lagen van het
-
transfer system. Buffer
(Semi-)Dry bloing
Blotting papier en het membraan worden van tevoren nat gemaakt (opbouw: anode, papier, membraan,
gel, papier, cathode)
Snelle transfer:
DNA: 10 min
RNA: 30-35 min
Als het te heet wordt, smelt je agarose gel dus let op bij het instellen!
Je DNA moet klein genoeg zijn om door de gel heen te komen DNA depurineren om te
fragmenteren
Als laatste fixeren om de nucleïnezuren permanent te laten binden aan het membraan door middel van
crosslinks. Dit is gemakkelijk uit te voeren in de magnetron!
Concept 2.2 Labeling methodes
Polymerase I
Functie in replicatie en reparatie van DNA, wordt ook gebruikt bij het maken van probes
Activiteiten:
5’ - 3’ DNA-dependent DNA polymerase, voegt nucleotides toe aan de 3’-OH kant, maar heeft
een primer nodig als beginpunt
5’ - 3’ exonuclease (nick translation), een gaatje in de fosfaatbackbone veroorzaakt een nick
3’- 5’ exonuclease (proofreading), haalt de fouten eruit
5’ - 3’ RNA-dependent DNA polymerase
DNA 5’ End labeling
T4 polynucleotide kinase katalyseert de verwisseling van Pi van ATP
5’ ->
naar de 5’-OH ternminus van polynucleotides. Kinase fosforliseerd =
-I 5’
koppelt een radioactief fosfaat toe
DNA 3’ End labeling
Terminal transferase (TdT): template independent polymerase. Toevoeging
van deoxynucleotides aan de 3’-OH terminus van DNA moleculen. -I 3’
Nadeel: doordat er een zich een probe bevindt aan het 3’-eind, is -
verlenging door PCR niet mogelijk, want hij heeft geen vrije OH-groep
meer!
Single Nucleotide Terminator labeling
Terminator DNA polymerase, de opname van een enkele base of dideoxy -
en acylclonucleotides -
,Nick translation
Nick
De nick veroorzaakt een vrije 3’-OH, waardoor DNA polymerase I de DNA
streng kan verlengen. Hij verwijderd daarbij de nucleotide in de synthese -
richting door 5’ - 3’ exonuclease activiteit -
De nick is random, daarom is het handig als je template helemaal zuiver is
Primers
Random priming -
Klenow subunit of DNA polymerase: beschikt over 5’ 3’ polymerase -
activiteit en 3’ 5’ exonuclease (proofreading) activiteit, maar mist -
5’ 3’ exonuclease activiteit -
Concept 2.3 Probes label types
Isotopic labeling: (radioactief) wordt gedetecteerd door blootstelling aan X-ray
Voorbeelden radioactief label: P, P, S of H
32 3335 3
Non-isotopic labeling (niet radioactief) omvat:
Direct labeling: m.b.v. gemodificeerde nucleotiden die een fluorfoor bevatten
Indirect labeling: m.b.v. een reportermolecuul gehecht aan een nucleotideprecursor. Veel gebruikte
methode zijn; Biotine-Streptavidine en Digoxigenine (DIG)
Voorbeelden niet-radioactief label: Broom, DIG, Biotine en fluorescente moleculen
Concept 2.4 Principe en factoren bij hybridisatie
Smelt temperatuur
Tm: de temperatuur waarbij 50% van een DNA sequentie gehybridiseerd is met zijn complementaire
streng
Tm van een dsDNA moleculen langer dan 50 nucleotiden lang is afhankelijk van:
Lengte in bp
GC content (hoe maar GC, hoe hoger de Tm)
Zout concentratie
Formamide concentratie
Hybridisatie buffer componenten
NaCl: Na is positief geladen en schermt de negatieve lading van de suikerfosfaat backbone af,
waardoor de probe kan annealen met het gebonden DNA. Hoe meer zout, streng wordt minder
negatief, makkelijke binding - Hoe minder zout, streng blijft negatief, moeilijke binding (negatief en
negatief stoot elkaar af en kan dus niet binden)
Detergentia en blocking agents: melkpoeder, heparine, SDS en BSA voorkomen van niet-specifieke
(hydrofobe) bindingen aan het membraan
Rate enhancers: Dextraansulfaat, Ficoll, polyvinylpyrolidon (grote hydrofiele moleculen)
vergemakkelijken de hybridisatie, waardoor de strengen elkaar beter zullen vinden & binden
Denaturants: Uream of Formamide verlagen de Tm (hybridisatie temperatuur), wanneer probe, label of
membraan niet stabiel zijn bij hoge temperaturen
, Hybridisatie stringentie
Stringentie: bindingssterkte tussen de probe en de target
Hoog/ sterk stringent: complementaire sequenties zijn niet zo’n stabiel duplex (hoge temperaturen,
lage [NaCl] en hoge denaturants)
Laag/ zwak stringent: zijn niet erg complementair en vormen een stabiel duplex (lage temperaturen,
hoge [NaCl] en lage denaturants)
Wanneer je probe lang genoegen is, kan een conventional DNA probe met een 20% mismatch toch
binden
Hybridisatie stappen
Pre-hybridisatie: membraan equilibratie en voorkomen van niet-specifieke binding
Hybridisatie, stringentie:
Temperatuur: 42 C met formamide of 65 C wanneer >16h
Heterologe probes: lagere hybridisatie temperatuur 40-55 C zonder formamide
Achtergrond (afhankelijk van blocking efficiëntie, concentratie van probe, stringentie van wassen)
Concentratie probe 10-125 ng/mL
Post-hybridisatie: was-stap om ongebonden probe te verwijderen (met de juist zoutconcentratie)
Door hoge stringentie wordt aspecifieke bindingen voorkomen mooie & zuivere bandjes,
temperatuur wordt verhoogt van 50 C naar 65 C
