CLASE 1
Pasos de un bioproceso - cultivo de un microorganismo que produce una proteína
recombinante de interés
1. Stock: en el freezer, en un medio de cultivo con glicerol (LB ex en placas) +
antibiótico para selección + medio agarizado (placa) o liquido (erlenmeyer)
2. Se esterilizan los elementos en autoclave
3. Se aumenta el volumen del cultivo (aumentar la escala) - suele hacerse de 10 a 100,
de 100 a 1000
4. Para tener oxígeno en el erlenmeyer no se debe llenar mucho el erlenmeyer (un
10% del volumen que pueda contener) y se obtiene mediante agitación
5. Para pasar de 1 litro a 10 litros, se usa un biorreactor/fermentador
6. El biorreactor tiene una paleta que agita (son de 2 litros a X litros) y el medio debe
estar esteril
7. Si la proteína es inducible se debe inducir con IPTG ex
8. Centrifugado - pellet y sobrenadante
9. Filtración y resuspensión del pellet
10. Lisis de la bacteria (quimica o fisica) - ex por sonicación, SDS
11. Con la proteína en el medio se debe separar la proteína del resto de las moléculas
(purificación)
12. Alicuotación, secado de las proteínas
- En el batch el volumen es constante, no sale volumen del biorreactor
- En un mismo reactor se pueden llevar a cabo distintos sistemas de cultivo
Sistemas de cultivo: batch, batch alimentado, cultivo continuo
Bioproceso
Es la transformación de un sustrato determinado en productos mediante microorganismos,
cultivos de células animales o vegetales o por materiales derivados de estos como las
enzimas.
Upstream —> Bioproceso—> Downstream
1. Diseno preparacion y esterilizacion (I+D)
2. Bioproceso
3. Recuperacion y purificacion del producto
Fermentacion
- El m.o. usa sustratos para generar productos de interés
- Es un tipo de metabolismo de un mo
- NO todos los bioprocesos son fermentación
Los biorreactores están conectados a una máquina/computadora que permite regular y
medir diferentes factores
De qué depende el bioproceso
,Efectores internos: Genética del MO y sus mecanismos de regulación metabólica.
• Efectores externos: Constituyen las variables de naturaleza física o química.
Internos
● Metabolismo
● Nutrientes, cofactores, etc.
● Producto
Externos
● Variables físicas de control del sistema
● Variables químicas.
● Diseño del “fermentador” o reactor.
● Disponibilidad y transferencia
● de nutrientes.
Medios de cultivo
El costo de los nutrientes representa entre el 10 y 60 % del costo total del proceso.
A) Componentes:
• Macronutrientes: (g/l) C, N, S, P, K y Mg
• Micronutrientes o elementos traza: (mg/l) Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co
• Factores de crecimiento: compuestos orgánicos en baja concentración que no son
metabolizados por las células, incorporados a estructuras celulares: vitaminas, aminoácidos
esenciales, etc.
B) Clasificación:
• Sintéticos o DEFINIDOS
, • Complejos, de composición variable (sustancias de origen animal o vegetal, peptonas,
extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja) o INDEFINIDOS
Como regla general, supondremos que todos los medios de cultivo utilizados son
DEFINIDOS:
• FCE (fuente de carbono y energía): Por ejemplo: glucosa, glicerol.
• FN (Fuente de nitrógeno): Generalmente alguna sal de amonio, considerando el
par NH4+-NH3
Con los medios indefinidos el mo puede no producir determinadas cosas porque ya están
contenidas en el medio PERO son muy difíciles de replicar
Diseño del medio de cultivo
Elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de
productos correspondientes al proceso a desarrollar.
A tener en cuenta:
o Microorganismo
o Proceso
o Sustratos y sus especificaciones
Requerimientos nutricionales
a) CARBONO
Autotróficos: microorganismos que obtienen el carbono del CO2. Heterotróficos: requieren
compuestos orgánicos como fuente de carbono.
b) OXÍGENO
Microorganismos aerobios o anaerobios
c) NITRÓGENO
De naturaleza orgánica o inorgánica, utilizado para la biosíntesis de proteínas, ácidos
nucleicos y polímeros de la pared celular.
d) FÓSFORO (P) Y AZUFRE (S)
Suministrados en forma de HP04 y S04 (o aminoácidos azufrados). El P se incorpora en
ácidos nucleicos, y polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos
azufrados, biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes.
e) POTASIO (K) Y MAGNESIO (Mg)
Se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato. El K está involucrado
en la síntesis de ARN. Además, actúa como coenzima y como catión en la estructura
aniónica de varios componentes celulares. El Mg es esencial para la estabilidad de los
ribosomas y actúa como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo.
f) MICRONUTRIENTES
Esenciales: Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn
No esenciales: B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, I y Sn
Pasos de un bioproceso - cultivo de un microorganismo que produce una proteína
recombinante de interés
1. Stock: en el freezer, en un medio de cultivo con glicerol (LB ex en placas) +
antibiótico para selección + medio agarizado (placa) o liquido (erlenmeyer)
2. Se esterilizan los elementos en autoclave
3. Se aumenta el volumen del cultivo (aumentar la escala) - suele hacerse de 10 a 100,
de 100 a 1000
4. Para tener oxígeno en el erlenmeyer no se debe llenar mucho el erlenmeyer (un
10% del volumen que pueda contener) y se obtiene mediante agitación
5. Para pasar de 1 litro a 10 litros, se usa un biorreactor/fermentador
6. El biorreactor tiene una paleta que agita (son de 2 litros a X litros) y el medio debe
estar esteril
7. Si la proteína es inducible se debe inducir con IPTG ex
8. Centrifugado - pellet y sobrenadante
9. Filtración y resuspensión del pellet
10. Lisis de la bacteria (quimica o fisica) - ex por sonicación, SDS
11. Con la proteína en el medio se debe separar la proteína del resto de las moléculas
(purificación)
12. Alicuotación, secado de las proteínas
- En el batch el volumen es constante, no sale volumen del biorreactor
- En un mismo reactor se pueden llevar a cabo distintos sistemas de cultivo
Sistemas de cultivo: batch, batch alimentado, cultivo continuo
Bioproceso
Es la transformación de un sustrato determinado en productos mediante microorganismos,
cultivos de células animales o vegetales o por materiales derivados de estos como las
enzimas.
Upstream —> Bioproceso—> Downstream
1. Diseno preparacion y esterilizacion (I+D)
2. Bioproceso
3. Recuperacion y purificacion del producto
Fermentacion
- El m.o. usa sustratos para generar productos de interés
- Es un tipo de metabolismo de un mo
- NO todos los bioprocesos son fermentación
Los biorreactores están conectados a una máquina/computadora que permite regular y
medir diferentes factores
De qué depende el bioproceso
,Efectores internos: Genética del MO y sus mecanismos de regulación metabólica.
• Efectores externos: Constituyen las variables de naturaleza física o química.
Internos
● Metabolismo
● Nutrientes, cofactores, etc.
● Producto
Externos
● Variables físicas de control del sistema
● Variables químicas.
● Diseño del “fermentador” o reactor.
● Disponibilidad y transferencia
● de nutrientes.
Medios de cultivo
El costo de los nutrientes representa entre el 10 y 60 % del costo total del proceso.
A) Componentes:
• Macronutrientes: (g/l) C, N, S, P, K y Mg
• Micronutrientes o elementos traza: (mg/l) Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co
• Factores de crecimiento: compuestos orgánicos en baja concentración que no son
metabolizados por las células, incorporados a estructuras celulares: vitaminas, aminoácidos
esenciales, etc.
B) Clasificación:
• Sintéticos o DEFINIDOS
, • Complejos, de composición variable (sustancias de origen animal o vegetal, peptonas,
extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja) o INDEFINIDOS
Como regla general, supondremos que todos los medios de cultivo utilizados son
DEFINIDOS:
• FCE (fuente de carbono y energía): Por ejemplo: glucosa, glicerol.
• FN (Fuente de nitrógeno): Generalmente alguna sal de amonio, considerando el
par NH4+-NH3
Con los medios indefinidos el mo puede no producir determinadas cosas porque ya están
contenidas en el medio PERO son muy difíciles de replicar
Diseño del medio de cultivo
Elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de
productos correspondientes al proceso a desarrollar.
A tener en cuenta:
o Microorganismo
o Proceso
o Sustratos y sus especificaciones
Requerimientos nutricionales
a) CARBONO
Autotróficos: microorganismos que obtienen el carbono del CO2. Heterotróficos: requieren
compuestos orgánicos como fuente de carbono.
b) OXÍGENO
Microorganismos aerobios o anaerobios
c) NITRÓGENO
De naturaleza orgánica o inorgánica, utilizado para la biosíntesis de proteínas, ácidos
nucleicos y polímeros de la pared celular.
d) FÓSFORO (P) Y AZUFRE (S)
Suministrados en forma de HP04 y S04 (o aminoácidos azufrados). El P se incorpora en
ácidos nucleicos, y polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos
azufrados, biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes.
e) POTASIO (K) Y MAGNESIO (Mg)
Se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato. El K está involucrado
en la síntesis de ARN. Además, actúa como coenzima y como catión en la estructura
aniónica de varios componentes celulares. El Mg es esencial para la estabilidad de los
ribosomas y actúa como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo.
f) MICRONUTRIENTES
Esenciales: Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn
No esenciales: B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, I y Sn
