PATHOLOGIE
ONDERZOEKSMETHODEN
Eiwit detectie
Gelelektroforese
• Geladen moleculen, zoals DNA, RNA en eiwitten scheiden op basis van grootte
• Elektrisch veld met een gel met kleine poriën -> soort zeef
• DNA en RNA zijn negatief geladen en zullen naar positieve lading bewegen (naar beneden). Hoe
kleiner de moleculen hoe verder ze in de gel komen
• Bandjes krijg je als je van één bepaalde grootte, veel fragmenten hebt (DNA wel zichtbaar maken
met bv. fluorescentie). Door een marker toe te voegen, creëer je een referentie
• 2D-elektroforese begint met elektroforese in de eerste dimensie en scheidt vervolgens de
moleculen loodrecht van de eerste om een elektroferogram in de tweede dimensie te creëren.
Bij elektroforese in de eerste dimensie worden moleculen lineair gescheiden volgens hun iso-
elektrisch punt. In de tweede dimensie worden de moleculen vervolgens op 90 graden van het
eerste elektroferogram gescheiden volgens de molecuulmassa. Met 2D-elektroforese scheid je
de moleculen dus effectiever dan met 1D-elektroforese
• Voor het scheiden van eiwitten gebruik je SDS-PAGE
SDS-PAGE
• Eiwitten uit eiwitmengsel scheiden op basis van grootte (molecuulgewicht)
• Eiwitten zijn niet negatief geladen en daarom moeten de eiwitten gemengd worden met een
detergent, SDS. Hierdoor wordt het eiwit ontvouwen en krijgt het een lineaire vorm met een
negatieve lading. Op deze manier kunnen de eiwitten naar de positieve pool bewegen
• Monsters worden na elektroforese met Coomassie Blue gekleurd. Vervolgens worden de
monsters vergeleken met moleculaire ladder om molecuulgewicht te bepalen
• ß-mercapto-ethanol (reductans) of dithiothreitol (DTT) wordt toegevoegd om
zwavelverbindingen te verbreken
• Door de vouwing kan een eiwit zich kleiner voordoen dan dat die eigenlijk is. Dus dimeer is niet
per se 2x zo zwaar als monomeer
Western Blot
• Detectie van specifieke eiwitmoleculen in een mix van eiwitten. Kan ook gebruikt worden om de
grootte van een eiwit te bepalen en om de hoeveelheid eiwitexpressie te meten
• Wordt altijd voorafgegaan door SDS-page
• Eiwitten wordt getransporteerd vanaf gel naar blotting membraan. Vervolgens ondergaat het
membraan een behandeling die blocking wordt genoemd en die voorkomt dat niet-specifieke
reacties optreden. Het membraan wordt vervolgens geïncubeerd met een antilichaam dat het
primaire antilichaam wordt genoemd en dat specifiek bindt aan het eiwit van belang. Na
incubatie wordt eventueel ongebonden primair antilichaam weggewassen en wordt het
membraan opnieuw geïncubeerd, maar deze keer met een secundair antilichaam dat specifiek
het primaire antilichaam herkent en eraan bindt. Het secundaire antilichaam is gekoppeld aan
een reporter-enzym dat kleur of licht produceert, waardoor het gemakkelijk kan worden
gedetecteerd en afgebeeld. Deze stappen maken het mogelijk een specifiek eiwit te detecteren
uit een mengsel van eiwitten
• Een semi-kwantitatieve schatting van een eiwit kan worden afgeleid uit de grootte en
kleurintensiteit van een eiwitband op het blotmembraan.
• Toepassing: eiwit-eiwit interacties onderzoeken -> eiwit op membraan doen en dan andere
eiwitten toevoegen -> kijken of er complexen gevormd zijn dus of er eiwitinteracties zijn
, Microscopie
• Met HE-kleuring worden de celkernen paars aangekleurd en het cytoplasma licht roze. Het kleurt
alle cellen die op dat moment in het weefsel zitten
• Gramkleuring: positieve bacteriën kleuren blauw/paars en negatieve bacteriën rood/roze
Immuunhistochemie
• Met specifieke antistof een eiwit naar keuze aankleuren in een weefsel
• Voordelen: locatie van eiwit zien: membraan, cytoplasma of kern
• Nadelen: kwalitatief en niet kwantitatief, epitoop is niet altijd beschikbaar omdat deze al
gebonden is
Confocale microscopie
Als je echt in de cel wilt gaan kijken wordt er gebruik gemaakt van fluorescentie. Dit is veel gevoeliger
dan dat je gebruikt maakt van antistof met gewone kleuring.
In situ hybridisatie
• Type hybridisatie waarbij gebruik wordt gemaakt van een gelabelde
complementaire DNA-, RNA- of gemodificeerde nucleïnezuurstreng
(probe) om een specifieke DNA- of RNA-sequentie te lokaliseren in een
gedeelte of sectie van weefsel (in situ) of als het weefsel klein genoeg
is (bijv. plantenzaden, Drosophila-embryo's), in het gehele weefsel, in
cellen en in circulerende tumorcellen (CTC's).
• FISH (Fluorescentie-in-situhybridisatie) om locatie van DNA-sequenties
op mitotische chromosomen zichtbaar te maken
• Dit verschilt van immunohistochemie, die gewoonlijk eiwitten in
weefselcoupes lokaliseert.
• Het is een cruciale stap voor het begrijpen van de organisatie,
regulatie en functie van genen
cDNA maken
• Door cDNA te analyseren kan je expressiepatronen van bepaalde
eiwitten in verschillende weefsels analyseren
• cDNA kan je gebruiken om bacteriën grote hoeveelheden eiwit te produceren. In het cDNA zitten
alleen de exonen dus hoeft de bacterie niet nog te splicen.
• Met behulp van reverse transcriptase en een poly-T primer, zet je alle op dat moment aanwezige
mRNA’s uit de cellen om in dubbelstrengs-DNA. Er ontstaat een DNA streng die aan de hand van
mRNA is gemaakt = cDNA
• Je hebt dubbelstrengs molecuul (streng cDNA en streng mRNA), dus voeg je RNAse toe, die
mRNA in stukjes knipt. Vervolgens maak je andere steng cDNA → dsDNA
Antistoffen maken
• ‘Aangenomen dat er specifieke antilichamen zijn voor dit eiwit’
• Als je de antistoffen niet hebt, moet je die zelf maken:
o Monoklonale: muis →Meest specifiek, je hebt één specifiek epitoop
o Polyklonale: elk dier (kiezen voor paard, dit is een groot dier dus krijg je veel antistoffen)
→ Verschillende epitopen op één eiwit
ELISA
• Meten van eiwitten in bloedmonsters/serum -> eiwitconcentratie bepalen
• Kwantitatief
ONDERZOEKSMETHODEN
Eiwit detectie
Gelelektroforese
• Geladen moleculen, zoals DNA, RNA en eiwitten scheiden op basis van grootte
• Elektrisch veld met een gel met kleine poriën -> soort zeef
• DNA en RNA zijn negatief geladen en zullen naar positieve lading bewegen (naar beneden). Hoe
kleiner de moleculen hoe verder ze in de gel komen
• Bandjes krijg je als je van één bepaalde grootte, veel fragmenten hebt (DNA wel zichtbaar maken
met bv. fluorescentie). Door een marker toe te voegen, creëer je een referentie
• 2D-elektroforese begint met elektroforese in de eerste dimensie en scheidt vervolgens de
moleculen loodrecht van de eerste om een elektroferogram in de tweede dimensie te creëren.
Bij elektroforese in de eerste dimensie worden moleculen lineair gescheiden volgens hun iso-
elektrisch punt. In de tweede dimensie worden de moleculen vervolgens op 90 graden van het
eerste elektroferogram gescheiden volgens de molecuulmassa. Met 2D-elektroforese scheid je
de moleculen dus effectiever dan met 1D-elektroforese
• Voor het scheiden van eiwitten gebruik je SDS-PAGE
SDS-PAGE
• Eiwitten uit eiwitmengsel scheiden op basis van grootte (molecuulgewicht)
• Eiwitten zijn niet negatief geladen en daarom moeten de eiwitten gemengd worden met een
detergent, SDS. Hierdoor wordt het eiwit ontvouwen en krijgt het een lineaire vorm met een
negatieve lading. Op deze manier kunnen de eiwitten naar de positieve pool bewegen
• Monsters worden na elektroforese met Coomassie Blue gekleurd. Vervolgens worden de
monsters vergeleken met moleculaire ladder om molecuulgewicht te bepalen
• ß-mercapto-ethanol (reductans) of dithiothreitol (DTT) wordt toegevoegd om
zwavelverbindingen te verbreken
• Door de vouwing kan een eiwit zich kleiner voordoen dan dat die eigenlijk is. Dus dimeer is niet
per se 2x zo zwaar als monomeer
Western Blot
• Detectie van specifieke eiwitmoleculen in een mix van eiwitten. Kan ook gebruikt worden om de
grootte van een eiwit te bepalen en om de hoeveelheid eiwitexpressie te meten
• Wordt altijd voorafgegaan door SDS-page
• Eiwitten wordt getransporteerd vanaf gel naar blotting membraan. Vervolgens ondergaat het
membraan een behandeling die blocking wordt genoemd en die voorkomt dat niet-specifieke
reacties optreden. Het membraan wordt vervolgens geïncubeerd met een antilichaam dat het
primaire antilichaam wordt genoemd en dat specifiek bindt aan het eiwit van belang. Na
incubatie wordt eventueel ongebonden primair antilichaam weggewassen en wordt het
membraan opnieuw geïncubeerd, maar deze keer met een secundair antilichaam dat specifiek
het primaire antilichaam herkent en eraan bindt. Het secundaire antilichaam is gekoppeld aan
een reporter-enzym dat kleur of licht produceert, waardoor het gemakkelijk kan worden
gedetecteerd en afgebeeld. Deze stappen maken het mogelijk een specifiek eiwit te detecteren
uit een mengsel van eiwitten
• Een semi-kwantitatieve schatting van een eiwit kan worden afgeleid uit de grootte en
kleurintensiteit van een eiwitband op het blotmembraan.
• Toepassing: eiwit-eiwit interacties onderzoeken -> eiwit op membraan doen en dan andere
eiwitten toevoegen -> kijken of er complexen gevormd zijn dus of er eiwitinteracties zijn
, Microscopie
• Met HE-kleuring worden de celkernen paars aangekleurd en het cytoplasma licht roze. Het kleurt
alle cellen die op dat moment in het weefsel zitten
• Gramkleuring: positieve bacteriën kleuren blauw/paars en negatieve bacteriën rood/roze
Immuunhistochemie
• Met specifieke antistof een eiwit naar keuze aankleuren in een weefsel
• Voordelen: locatie van eiwit zien: membraan, cytoplasma of kern
• Nadelen: kwalitatief en niet kwantitatief, epitoop is niet altijd beschikbaar omdat deze al
gebonden is
Confocale microscopie
Als je echt in de cel wilt gaan kijken wordt er gebruik gemaakt van fluorescentie. Dit is veel gevoeliger
dan dat je gebruikt maakt van antistof met gewone kleuring.
In situ hybridisatie
• Type hybridisatie waarbij gebruik wordt gemaakt van een gelabelde
complementaire DNA-, RNA- of gemodificeerde nucleïnezuurstreng
(probe) om een specifieke DNA- of RNA-sequentie te lokaliseren in een
gedeelte of sectie van weefsel (in situ) of als het weefsel klein genoeg
is (bijv. plantenzaden, Drosophila-embryo's), in het gehele weefsel, in
cellen en in circulerende tumorcellen (CTC's).
• FISH (Fluorescentie-in-situhybridisatie) om locatie van DNA-sequenties
op mitotische chromosomen zichtbaar te maken
• Dit verschilt van immunohistochemie, die gewoonlijk eiwitten in
weefselcoupes lokaliseert.
• Het is een cruciale stap voor het begrijpen van de organisatie,
regulatie en functie van genen
cDNA maken
• Door cDNA te analyseren kan je expressiepatronen van bepaalde
eiwitten in verschillende weefsels analyseren
• cDNA kan je gebruiken om bacteriën grote hoeveelheden eiwit te produceren. In het cDNA zitten
alleen de exonen dus hoeft de bacterie niet nog te splicen.
• Met behulp van reverse transcriptase en een poly-T primer, zet je alle op dat moment aanwezige
mRNA’s uit de cellen om in dubbelstrengs-DNA. Er ontstaat een DNA streng die aan de hand van
mRNA is gemaakt = cDNA
• Je hebt dubbelstrengs molecuul (streng cDNA en streng mRNA), dus voeg je RNAse toe, die
mRNA in stukjes knipt. Vervolgens maak je andere steng cDNA → dsDNA
Antistoffen maken
• ‘Aangenomen dat er specifieke antilichamen zijn voor dit eiwit’
• Als je de antistoffen niet hebt, moet je die zelf maken:
o Monoklonale: muis →Meest specifiek, je hebt één specifiek epitoop
o Polyklonale: elk dier (kiezen voor paard, dit is een groot dier dus krijg je veel antistoffen)
→ Verschillende epitopen op één eiwit
ELISA
• Meten van eiwitten in bloedmonsters/serum -> eiwitconcentratie bepalen
• Kwantitatief
