Escuela Superior Politécnica del Litoral Fc
v
Facultad de ciencias de la vida
Biología Celular y Molecular
LABORATORIO PRÁCTICO
Facultad de
ciencias de la
vida
CÓDIGO
NOMBRE Analía Paulina Rodríguez Díaz BIOG1021
PROFESOR Eduardo Sánchez Timm
LABORATORIO Microbiología y técnicas moleculares
FECHA 01/Diciembre/2022 PARALELO 104
TEMA DE LA PRÁCTICA 3 Visualización de ADN genómico vegetal
OBJETIVOS:
Objetivo General:
Aplicar la visualización de ADN genómico de las muestras resultantes de la práctica 2 por medio
del uso de la electroforesis y el transiluminador para sus respectivas descripciones sobre la forma de
ADN y pares de bases.
Objetivos Específicos:
- Determinar la presencia de ADN en las muestras por medio de la observación de las bandas en el
transiluminador ultravioleta.
- Describir las bandas visualizadas en el transiluminador para el análisis de las formas que toma el
ADN y la estimación de sus pares de bases.
INTRODUCCIÓN:
La técnica de electroforesis es utilizada en el proceso de visualización de ADN debido a que tiene
como función principal separar fragmentos de este en función de su tamaño. El mecanismo de
acción del equipo trata de que al combinarse o potenciarse cargas eléctricas se produce el
desplazamiento y a la vez la división del ADN por tamaños, lo que sucede es que la carga negativa
del ácido desoxirribonucleico dentro de este campo eléctrico se moverá hacia su carga opuesta y
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vida
viceversa. Es aquí donde interviene el gel de agarosa, este gel tendrá como una malla tridimensional
conformado por agarosa, un polímero, dificultando o generando una fricción con la cual se
observará la tendencia de, si migran lento corresponderá a un fragmento de mayor tamaño, mientras
que si se mueven rápido se tratará de un fragmento de menor tamaño.
Las agarosas pueden ser estándar y de bajo punto de fusión donde para la primera, se requiere
disolverla en un buffer a temperatura entre 90 a 95°C y se solidifican a 35-45°C. La agarosa de bajo
punto de fusión se disuelve a 65°C y solidifica a 30-35°C. Este polímero puede disolverse en
buffers como TAE (Tris-Acetato EDTA) o TBE (Tris-Borato EDTA). El primero, el cual fue usado
cuando se preparó el gel de agarosa usado para la práctica, contiene una mayor capacidad de
resolución para tamaños grandes de ADN a comparación con el TBE. Usualmente son diluidas en
agua previo a la electroforesis para su concentración adecuada, TAE (1x) y para TBE (0.5x) y
también ambas pueden almacenarse a temperatura ambiente.
En la mezcla para la producción del gel de agarosa también se le puede incorporar un tinte que
cumpla la función de ser un marcador que intercala al ADN, es decir que permita la visualización
del ácido nucleico en el gel. Existen dos que son usados, el bromuro de etidio y el que se empleó en
la práctica, el SYBR Safe. El bromuro de etidio absorbe la luz ultravioleta y se emite una luz
anaranjada con la que se puede ver la posición y la cantidad de ADN, su sensibilidad es muy similar
con el SYBR Safe con la diferencia en que este último contiene una menor capacidad mutagénica y
es menos costoso (Fierro, 2014).
El SYBR Safe es un agente intercalante que se encuentra 10 000 x concentrado, por lo tanto,
cuando se requiera conocer la cantidad necesaria de agarosa para realizar el gel se recurre a la
fórmula donde el producto entre los microlitros de gel resultante y el volumen de la agarosa es igual
a la concentración del SYBR Safe empleado por el volumen final del gel de agarosa.
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TEMA DE LA PRÁCTICA 3 Visualización de ADN genómico vegetal
OBJETIVOS:
Objetivo General:
Aplicar la visualización de ADN genómico de las muestras resultantes de la práctica 2 por medio
del uso de la electroforesis y el transiluminador para sus respectivas descripciones sobre la forma de
ADN y pares de bases.
Objetivos Específicos:
- Determinar la presencia de ADN en las muestras por medio de la observación de las bandas en el
transiluminador ultravioleta.
- Describir las bandas visualizadas en el transiluminador para el análisis de las formas que toma el
ADN y la estimación de sus pares de bases.
INTRODUCCIÓN:
La técnica de electroforesis es utilizada en el proceso de visualización de ADN debido a que tiene
como función principal separar fragmentos de este en función de su tamaño. El mecanismo de
acción del equipo trata de que al combinarse o potenciarse cargas eléctricas se produce el
desplazamiento y a la vez la división del ADN por tamaños, lo que sucede es que la carga negativa
del ácido desoxirribonucleico dentro de este campo eléctrico se moverá hacia su carga opuesta y
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viceversa. Es aquí donde interviene el gel de agarosa, este gel tendrá como una malla tridimensional
conformado por agarosa, un polímero, dificultando o generando una fricción con la cual se
observará la tendencia de, si migran lento corresponderá a un fragmento de mayor tamaño, mientras
que si se mueven rápido se tratará de un fragmento de menor tamaño.
Las agarosas pueden ser estándar y de bajo punto de fusión donde para la primera, se requiere
disolverla en un buffer a temperatura entre 90 a 95°C y se solidifican a 35-45°C. La agarosa de bajo
punto de fusión se disuelve a 65°C y solidifica a 30-35°C. Este polímero puede disolverse en
buffers como TAE (Tris-Acetato EDTA) o TBE (Tris-Borato EDTA). El primero, el cual fue usado
cuando se preparó el gel de agarosa usado para la práctica, contiene una mayor capacidad de
resolución para tamaños grandes de ADN a comparación con el TBE. Usualmente son diluidas en
agua previo a la electroforesis para su concentración adecuada, TAE (1x) y para TBE (0.5x) y
también ambas pueden almacenarse a temperatura ambiente.
En la mezcla para la producción del gel de agarosa también se le puede incorporar un tinte que
cumpla la función de ser un marcador que intercala al ADN, es decir que permita la visualización
del ácido nucleico en el gel. Existen dos que son usados, el bromuro de etidio y el que se empleó en
la práctica, el SYBR Safe. El bromuro de etidio absorbe la luz ultravioleta y se emite una luz
anaranjada con la que se puede ver la posición y la cantidad de ADN, su sensibilidad es muy similar
con el SYBR Safe con la diferencia en que este último contiene una menor capacidad mutagénica y
es menos costoso (Fierro, 2014).
El SYBR Safe es un agente intercalante que se encuentra 10 000 x concentrado, por lo tanto,
cuando se requiera conocer la cantidad necesaria de agarosa para realizar el gel se recurre a la
fórmula donde el producto entre los microlitros de gel resultante y el volumen de la agarosa es igual
a la concentración del SYBR Safe empleado por el volumen final del gel de agarosa.
