Escuela Superior Politécnica del Litoral Fc
v
Facultad de ciencias de la vida
Biología Celular y Molecular
LABORATORIO PRÁCTICO
Facultad de
ciencias de la
vida
CÓDIGO
NOMBRE Analía Paulina Rodríguez Díaz BIOG1021
PROFESOR Eduardo Sánchez Timm
LABORATORIO Microbiología y técnicas moleculares
FECHA 17/Noviembre/2022 PARALELO 104
TEMA DE LA PRÁCTICA 2 Extracción de ADN genómico vegetal
OBJETIVOS:
Objetivo General:
Aplicar la extracción de ADN de una materia vegetal mediante el protocolo del reactivo CTAB para
el aprendizaje sobre su proceso.
Objetivos Específicos:
- Explicar la obtención de las tres fases dentro de la muestra posterior a la adición de cloroformo-
isoamil para el reconocimiento de su importancia en el proceso de extracción de ADN.
- Determinar la presencia de ADN en el precipitado por medio de la observación del pellet luego de
la adición de etanol.
INTRODUCCIÓN:
En diferentes campos como la agrícola y de la medicina, identificar genes o mutaciones se
considera realmente importante para procedimientos y descubrimientos en la sociedad. Y esta
actividad es realizada a partir de la extracción y purificación de ADN o ácido desoxirribonucleico
para luego ser intervenida por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para su respectivo análisis
genómico.
, Escuela Superior Politécnica del Litoral Fc
v
Facultad de ciencias de la vida
Biología Celular y Molecular
LABORATORIO PRÁCTICO
Facultad de
ciencias de la
vida
Uno de los protocolos para extraer ADN de material vegetal es el método con CTAB. Este es un
proceso diseñado para eliminar polisacáridos y compuestos polifenólicos dentro de ADN vegetal,
siendo estos, factores que podrían alterar la pureza del ADN y su calidad. Con el CTAB, se ayuda
en la lisis celular debido a que representa el detergente iónico bromuro de cetil-trimetil amonio
formando un complejo no soluble entre el medio hiposalino y los ácidos nucleicos. Con su uso se
puede eliminar, como se ha mencionado anteriormente, polisacáridos, compuestos fenólicos y otros
contaminantes que se ubican en el sobrenadante y luego se los puede retirar completamente por
lavado.
Primero, antes de llevar a cabo la lisis de la membrana celular, es necesario la preparación de la
muestra. Si es una muestra seca, en el caso de la práctica que se empleó hojas secas, se requiere
simplemente de triturarlas lo más posible con un mortero hasta que quede pulverizado. Pero, si se
trata de muestras más frescas es menester secarlas a una cierta temperatura (por ejemplo 45°C),
agregarle PVP, que más adelante se explicará su función, y la utilización de nitrógeno líquido a -
196°C para conservarla en frío (Lacayo et al., 2020) y luego se procederá a demolerla. Luego de
esto, para el rompimiento de la membrana celular se emplea un tampón o buffer de extracción que
contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Además, con una concentración salina como NaCl se le facilita
al detergente producir un complejo insoluble con los ácidos nucleicos. Con el EDTA, se pretende
separar iones metálicos como el magnesio para disminuir la actividad de la desoxirribonucleasa
evitando su degradación. El Tris-HCl puede amortiguar el pH debido a que un elevado o disminuido
pH podría dañar al ADN.
Continuando con el protocolo, al momento de la extracción si se cuenta con concentraciones bajas
de cloruro de sodio (< 0.5 M) será necesario usar cloroformo para desnaturalizar las proteínas y
separar las fases tanto acuosa como orgánica, y si no se ha controlado el pH, los ácidos nucleicos
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NOMBRE Analía Paulina Rodríguez Díaz BIOG1021
PROFESOR Eduardo Sánchez Timm
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FECHA 17/Noviembre/2022 PARALELO 104
TEMA DE LA PRÁCTICA 2 Extracción de ADN genómico vegetal
OBJETIVOS:
Objetivo General:
Aplicar la extracción de ADN de una materia vegetal mediante el protocolo del reactivo CTAB para
el aprendizaje sobre su proceso.
Objetivos Específicos:
- Explicar la obtención de las tres fases dentro de la muestra posterior a la adición de cloroformo-
isoamil para el reconocimiento de su importancia en el proceso de extracción de ADN.
- Determinar la presencia de ADN en el precipitado por medio de la observación del pellet luego de
la adición de etanol.
INTRODUCCIÓN:
En diferentes campos como la agrícola y de la medicina, identificar genes o mutaciones se
considera realmente importante para procedimientos y descubrimientos en la sociedad. Y esta
actividad es realizada a partir de la extracción y purificación de ADN o ácido desoxirribonucleico
para luego ser intervenida por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para su respectivo análisis
genómico.
, Escuela Superior Politécnica del Litoral Fc
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ciencias de la
vida
Uno de los protocolos para extraer ADN de material vegetal es el método con CTAB. Este es un
proceso diseñado para eliminar polisacáridos y compuestos polifenólicos dentro de ADN vegetal,
siendo estos, factores que podrían alterar la pureza del ADN y su calidad. Con el CTAB, se ayuda
en la lisis celular debido a que representa el detergente iónico bromuro de cetil-trimetil amonio
formando un complejo no soluble entre el medio hiposalino y los ácidos nucleicos. Con su uso se
puede eliminar, como se ha mencionado anteriormente, polisacáridos, compuestos fenólicos y otros
contaminantes que se ubican en el sobrenadante y luego se los puede retirar completamente por
lavado.
Primero, antes de llevar a cabo la lisis de la membrana celular, es necesario la preparación de la
muestra. Si es una muestra seca, en el caso de la práctica que se empleó hojas secas, se requiere
simplemente de triturarlas lo más posible con un mortero hasta que quede pulverizado. Pero, si se
trata de muestras más frescas es menester secarlas a una cierta temperatura (por ejemplo 45°C),
agregarle PVP, que más adelante se explicará su función, y la utilización de nitrógeno líquido a -
196°C para conservarla en frío (Lacayo et al., 2020) y luego se procederá a demolerla. Luego de
esto, para el rompimiento de la membrana celular se emplea un tampón o buffer de extracción que
contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Además, con una concentración salina como NaCl se le facilita
al detergente producir un complejo insoluble con los ácidos nucleicos. Con el EDTA, se pretende
separar iones metálicos como el magnesio para disminuir la actividad de la desoxirribonucleasa
evitando su degradación. El Tris-HCl puede amortiguar el pH debido a que un elevado o disminuido
pH podría dañar al ADN.
Continuando con el protocolo, al momento de la extracción si se cuenta con concentraciones bajas
de cloruro de sodio (< 0.5 M) será necesario usar cloroformo para desnaturalizar las proteínas y
separar las fases tanto acuosa como orgánica, y si no se ha controlado el pH, los ácidos nucleicos
