Samenvatting RT-qPCR
1. RNA isolatie
Er zijn verschillende methoden om RNA te isoleren, vaak wordt voor deze
procedure kits gebruikt waarbij meestal geen fenol wordt gebruikt. Als er gewerkt
wordt met RNA is contaminatie een belangrijk aspect omdat ribonucleases
moeilijk af te inactiveren zijn. Om zo veel mogelijk RNase vrij te werken wordt
aangeraden om snel en koud te werken. Het is ook slim om oplossingen in EDTA
te behouden doordat dit ervoor zorgt dat tweewaardige kationen worden
vervangen, Mg2+ valt dan weg waardoor enzymen inactief worden. In humane
cellen zitten moleculen die overeenkomstig zijn met RNase. Puur RNA is erg
gevoelig voor RNase, daarom wordt vaak carrier-RNA toegevoegd om ervoor te
zorgen dat het pure RNA gedekt wordt. Ook wordt met de isolatie vaak in de
eerste stap een oplossing gebruikt dat de RNases denatureert. DEPC wordt ook
gebruikt om RNases te alkyleren, een nadeel is dat DEPC de PCR remt. Tris
buffers kunnen niet behandeld worden met DEPC. RNA uit elke cel kan worden
gekopieerd in dubbelstrengs DNA en kan worden gekloneerd waardoor een cDNA
library ontstaat voor een specifiek celtype, om ervoor te zorgen dat dit werkt
wordt full-length RNA gebruikt als start materiaal.
1.1 RNA isolatie methoden
Phenol chloroform
Het lyseren van de cellen wordt uitgevoerd door NP-40,
dit is een zeep die de celwand kapot maakt maar de
kern intact houdt. Tijdens deze stap wordt het DNA
kwijtgeraakt, en het verwijderen van eiwitten gebeurt
door phenol extractie. De phenol zorgt ervoor dat de
eiwitten en membranen uit elkaar vallen. Chloroform
zorgt ervoor dat er een fase scheiding ontstaat, ook
denatureert het eiwitten en lipiden. Isoamyl alchohol
(IAA) zorgt ervoor dat het chloroform niet gaat
schuimen.
Guanine-detergent oplossing
Voorbeelden van deze isolatiemethoden zijn Tripure, RNazol en trizol. De
methode maakt gebruik van chaotrope zouten zoals guanine thiocyanaat, deze
verbreken het celmembraan en denatureren eiwitten. Het chloroform wordt ook
toegevoegd voor de fasescheiding zoals hierboven vermeld. De waterige fase
(wit) bevat het RNA en de organische fase (rood) bevat de eiwitten.
Boom-silica methode
Bij deze methode wordt een lysis buffer toegevoegd, deze buffer bevat ook
chaotrope zouten waardoor het celmembraan openbreekt en alles in de cel vrij
komt. Vervolgens wordt silica toegevoegd waaraan nucleïne zuren binden. DNase
wordt toegevoegd om te voorkomen dat het DNA aan de silica bindt. Vervolgens
wordt gewassen met ethanol om het DNA weg te wassen, ook hechten eiwitten
door de ethanol minder snel. Daarna zal door middel van een elutiebuffer het
RNA loslaten
,en is er RNA geïsoleerd.
Oligo dT voor mRNA isolatie
mRNA kan geïsoleerd worden door middel van een oligo dT methode. mRNA
bevat een poly A staart, een bepaalde bead met een oligo dT
sequentie bindt aan deze poly A staart de rest van het DNA en
RNA wordt weggewassen waarna mRNA geëlueerd kan worden.
High pure isolation kit
Dit wordt gebruikt voor de bereiding van totaal RNA van
gecultuurde cellen, de samples worden eerst gelyseerd en
gehomogeniseerd in de aanwezigheid van een chaotrope zout en
worden dan op een spin filter tube gebracht. Nucleïne zuren
binden specifiek aan het filter, ook wordt DNase I toegevoegd om
het DNA af te breken.
Dynabeads mRNA direct
Dit is een kit die uitgevonden is voor een snelle isolatie van hoog
zuivere en intact mRNA direct van weefsels. De kit hangt af van
de baseparing tussen de poly A staart en de oligo Dt die covalent
gebonden zijn aan de dynabeads. Dit zijn uniforme,
supermagnetische polymeerdeeltjes. De uniformiteit zorgt voor
een snelle en efficiente binding van het target aan de bead. De
sferische vorm zorgt voor de eliminatie van niet-specifieke
bindingen.
DNazol vs RNazol
Er zit een groot verschil tussen DNazol en RNazol, zo heeft
DNazol een pH van 8,5 terwijl de pH van RNazol lager rond de 4
tot 6 ligt. DNA en RNA kolommen zijn wel deels identiek alleen is
het buffersysteem anders. De zoutconcentratie is lager bij RNA
omdat deze binden bij een lage zoutconcentratie. De
zoutconcentratie van DNA is hoger. Het verschil in pH kan worden
verklaard door doordat bij het werken met een hoge pH het RNA
wordt afgebroken. Bij een klein volume DNA en RNA wordt ook
vooral ethanol gebruikt omdat hier 2 tot 2,5 keer zoveel DNA/RNA
bij moet, isopropanol wordt in kleinere volumes toegevoegd bij grotere
hoeveelheden RNA, ook wordt het RNA niet neergeslagen door isopropanol, dit
kan een struikelblok zijn.
1.2 RNA kwantificatie
In een humane cel kan ongeveer 10-30 pg RNA zitten, het grootste deel van dit
RNA is rRNA (80%). Dit rRNA bestaat uit twee subunits, namelijk 18 en 28S. Het
tRNA neemt ongeveer 15% van het totale RNA in, terwijl mRNA als minst
aanwezig is met een kleine 5%. Als geïsoleerd RNA op gel wordt gezet geeft dit
, de volgende uitkomst. De ribosomale subunit 28S geeft meestal het grootste
fragment, kort daaronder zal de 18S unit zichtbaar zijn. Onderin de gel zitten de
kleine fragment 5S en tRNA. Als mRNA aanwezig is in het isolaat dan wordt dit
weergegeven als een smeer.
OD measurement
Tijdens de spectrofotometrische bepaling wordt gemeten bij 260 nanometer.
Hierbij worden alle dubbele bindingen van de basen gemeten. Alleen nucleïne
zuren worden dus bij deze golflengte gemeten. Dubbelstrengs DNA heeft een
concentratie van 50 ug/ul, enkelstrengs DNA heeft een concentratie van 40 ug/ul
en RNA heeft ook een concentratie van 40 ug/ul. Eiwitten absorberen bij 280
nanometer, het tryptofaan en phenol wordt dan gemeten. Bij 230-240 nanometer
wordt vaak contaminatie of storende factoren gemeten, hierbij kan gedacht
worden aan ethanol of EDTA. De zuiverheid van DNA kan worden uitgedrukt als
≥1,8. Voor RNA is dit ≥2,0. De concentratie RNA kan berekend worden om de
yield te bepalen:
1. Volume van het RNA = 80 ul
2. Verdunning = 2 ul sample in 248 ul water
3. A260 = 0,17
4. Concentratie RNA in het sample is dus:
A 260 x concentratie ( 40ulng ) x verdunningsfactor
Dit is dus: 0,17 x 40 x 125 = 850 ug/ml = 0,85 ug/ul RNA
5. De hoeveelheid RNA in het sample is dan:
concentratie x volume
Dit is dus: 0,85 x 80 = 68 ug RNA
Ook kan de contaminatie van het PCR product worden berekend:
1. De lengte van het product= 400 bp
2. Het moleculair gewicht = 264.000
3. Er worden 30 cycli gebruikt met het volume 10 ul na deze cycli
4. Er zijn 20 target moleculen per 10 ul
5. Yield = 2,6 ug
6. Het aantal moleculen kan worden berekend:
yield
( moleculair gewicht )
x 6 x 10 23
Dit is dus: 2,6 x 10 -.000 x 6 x 10 23 = 6 x 1012 moleculen
7. 20 target moleculen in 10 ul dus 6 x 10 = 3 x 1011 ul dit is 3x106 Liter
Gelelektroforese
Een gel wordt gebruikt om snel te kijken of het RNA juist geïsoleerd is. Om een
grootte te bepalen zal ook een blot moeten worden uitgevoerd op een
denaturerende gel omdat zo het RNA lineair wordt. Om een gel te denatureren
wordt Ureum of formamide. Voor RNA integriteit meting wordt meestal een 0,8-
1. RNA isolatie
Er zijn verschillende methoden om RNA te isoleren, vaak wordt voor deze
procedure kits gebruikt waarbij meestal geen fenol wordt gebruikt. Als er gewerkt
wordt met RNA is contaminatie een belangrijk aspect omdat ribonucleases
moeilijk af te inactiveren zijn. Om zo veel mogelijk RNase vrij te werken wordt
aangeraden om snel en koud te werken. Het is ook slim om oplossingen in EDTA
te behouden doordat dit ervoor zorgt dat tweewaardige kationen worden
vervangen, Mg2+ valt dan weg waardoor enzymen inactief worden. In humane
cellen zitten moleculen die overeenkomstig zijn met RNase. Puur RNA is erg
gevoelig voor RNase, daarom wordt vaak carrier-RNA toegevoegd om ervoor te
zorgen dat het pure RNA gedekt wordt. Ook wordt met de isolatie vaak in de
eerste stap een oplossing gebruikt dat de RNases denatureert. DEPC wordt ook
gebruikt om RNases te alkyleren, een nadeel is dat DEPC de PCR remt. Tris
buffers kunnen niet behandeld worden met DEPC. RNA uit elke cel kan worden
gekopieerd in dubbelstrengs DNA en kan worden gekloneerd waardoor een cDNA
library ontstaat voor een specifiek celtype, om ervoor te zorgen dat dit werkt
wordt full-length RNA gebruikt als start materiaal.
1.1 RNA isolatie methoden
Phenol chloroform
Het lyseren van de cellen wordt uitgevoerd door NP-40,
dit is een zeep die de celwand kapot maakt maar de
kern intact houdt. Tijdens deze stap wordt het DNA
kwijtgeraakt, en het verwijderen van eiwitten gebeurt
door phenol extractie. De phenol zorgt ervoor dat de
eiwitten en membranen uit elkaar vallen. Chloroform
zorgt ervoor dat er een fase scheiding ontstaat, ook
denatureert het eiwitten en lipiden. Isoamyl alchohol
(IAA) zorgt ervoor dat het chloroform niet gaat
schuimen.
Guanine-detergent oplossing
Voorbeelden van deze isolatiemethoden zijn Tripure, RNazol en trizol. De
methode maakt gebruik van chaotrope zouten zoals guanine thiocyanaat, deze
verbreken het celmembraan en denatureren eiwitten. Het chloroform wordt ook
toegevoegd voor de fasescheiding zoals hierboven vermeld. De waterige fase
(wit) bevat het RNA en de organische fase (rood) bevat de eiwitten.
Boom-silica methode
Bij deze methode wordt een lysis buffer toegevoegd, deze buffer bevat ook
chaotrope zouten waardoor het celmembraan openbreekt en alles in de cel vrij
komt. Vervolgens wordt silica toegevoegd waaraan nucleïne zuren binden. DNase
wordt toegevoegd om te voorkomen dat het DNA aan de silica bindt. Vervolgens
wordt gewassen met ethanol om het DNA weg te wassen, ook hechten eiwitten
door de ethanol minder snel. Daarna zal door middel van een elutiebuffer het
RNA loslaten
,en is er RNA geïsoleerd.
Oligo dT voor mRNA isolatie
mRNA kan geïsoleerd worden door middel van een oligo dT methode. mRNA
bevat een poly A staart, een bepaalde bead met een oligo dT
sequentie bindt aan deze poly A staart de rest van het DNA en
RNA wordt weggewassen waarna mRNA geëlueerd kan worden.
High pure isolation kit
Dit wordt gebruikt voor de bereiding van totaal RNA van
gecultuurde cellen, de samples worden eerst gelyseerd en
gehomogeniseerd in de aanwezigheid van een chaotrope zout en
worden dan op een spin filter tube gebracht. Nucleïne zuren
binden specifiek aan het filter, ook wordt DNase I toegevoegd om
het DNA af te breken.
Dynabeads mRNA direct
Dit is een kit die uitgevonden is voor een snelle isolatie van hoog
zuivere en intact mRNA direct van weefsels. De kit hangt af van
de baseparing tussen de poly A staart en de oligo Dt die covalent
gebonden zijn aan de dynabeads. Dit zijn uniforme,
supermagnetische polymeerdeeltjes. De uniformiteit zorgt voor
een snelle en efficiente binding van het target aan de bead. De
sferische vorm zorgt voor de eliminatie van niet-specifieke
bindingen.
DNazol vs RNazol
Er zit een groot verschil tussen DNazol en RNazol, zo heeft
DNazol een pH van 8,5 terwijl de pH van RNazol lager rond de 4
tot 6 ligt. DNA en RNA kolommen zijn wel deels identiek alleen is
het buffersysteem anders. De zoutconcentratie is lager bij RNA
omdat deze binden bij een lage zoutconcentratie. De
zoutconcentratie van DNA is hoger. Het verschil in pH kan worden
verklaard door doordat bij het werken met een hoge pH het RNA
wordt afgebroken. Bij een klein volume DNA en RNA wordt ook
vooral ethanol gebruikt omdat hier 2 tot 2,5 keer zoveel DNA/RNA
bij moet, isopropanol wordt in kleinere volumes toegevoegd bij grotere
hoeveelheden RNA, ook wordt het RNA niet neergeslagen door isopropanol, dit
kan een struikelblok zijn.
1.2 RNA kwantificatie
In een humane cel kan ongeveer 10-30 pg RNA zitten, het grootste deel van dit
RNA is rRNA (80%). Dit rRNA bestaat uit twee subunits, namelijk 18 en 28S. Het
tRNA neemt ongeveer 15% van het totale RNA in, terwijl mRNA als minst
aanwezig is met een kleine 5%. Als geïsoleerd RNA op gel wordt gezet geeft dit
, de volgende uitkomst. De ribosomale subunit 28S geeft meestal het grootste
fragment, kort daaronder zal de 18S unit zichtbaar zijn. Onderin de gel zitten de
kleine fragment 5S en tRNA. Als mRNA aanwezig is in het isolaat dan wordt dit
weergegeven als een smeer.
OD measurement
Tijdens de spectrofotometrische bepaling wordt gemeten bij 260 nanometer.
Hierbij worden alle dubbele bindingen van de basen gemeten. Alleen nucleïne
zuren worden dus bij deze golflengte gemeten. Dubbelstrengs DNA heeft een
concentratie van 50 ug/ul, enkelstrengs DNA heeft een concentratie van 40 ug/ul
en RNA heeft ook een concentratie van 40 ug/ul. Eiwitten absorberen bij 280
nanometer, het tryptofaan en phenol wordt dan gemeten. Bij 230-240 nanometer
wordt vaak contaminatie of storende factoren gemeten, hierbij kan gedacht
worden aan ethanol of EDTA. De zuiverheid van DNA kan worden uitgedrukt als
≥1,8. Voor RNA is dit ≥2,0. De concentratie RNA kan berekend worden om de
yield te bepalen:
1. Volume van het RNA = 80 ul
2. Verdunning = 2 ul sample in 248 ul water
3. A260 = 0,17
4. Concentratie RNA in het sample is dus:
A 260 x concentratie ( 40ulng ) x verdunningsfactor
Dit is dus: 0,17 x 40 x 125 = 850 ug/ml = 0,85 ug/ul RNA
5. De hoeveelheid RNA in het sample is dan:
concentratie x volume
Dit is dus: 0,85 x 80 = 68 ug RNA
Ook kan de contaminatie van het PCR product worden berekend:
1. De lengte van het product= 400 bp
2. Het moleculair gewicht = 264.000
3. Er worden 30 cycli gebruikt met het volume 10 ul na deze cycli
4. Er zijn 20 target moleculen per 10 ul
5. Yield = 2,6 ug
6. Het aantal moleculen kan worden berekend:
yield
( moleculair gewicht )
x 6 x 10 23
Dit is dus: 2,6 x 10 -.000 x 6 x 10 23 = 6 x 1012 moleculen
7. 20 target moleculen in 10 ul dus 6 x 10 = 3 x 1011 ul dit is 3x106 Liter
Gelelektroforese
Een gel wordt gebruikt om snel te kijken of het RNA juist geïsoleerd is. Om een
grootte te bepalen zal ook een blot moeten worden uitgevoerd op een
denaturerende gel omdat zo het RNA lineair wordt. Om een gel te denatureren
wordt Ureum of formamide. Voor RNA integriteit meting wordt meestal een 0,8-
