GENOME ANALYSIS
WEEK 5
Een belangrijk deel dat past bij sequencing is het Human Genome Project. Dit is een
aanleiding geweest voor bijna alle nieuwe generatie sequencing methoden die er op dit
moment beschikbaar zijn. Ergens in de jaren 90 wilden ze graag achter de sequentie van het
humane genoom komen, omdat ze zo dachten alle ziektes op te lossen (helaas niet zo
simpel).
Het Human Genome Project is begonnen met het bepalen van het humane genoom (op
chromosoom niveau) en welke stukken matchen waar. Vervolgens zijn er allerlei nieuwe
ontwikkelingen geweest, zijn we op het punt gekomen waar we nu zitten namelijk het
afronden van het HGP in 2004. En vanaf daar is de sequencing een heel groot onderdeel
geworden in de biologie en heeft een heel groot deel overgenomen.
Voor 2004 waren er vrij weinig genomen gesequenced en rond 2008/2010 waren de nieuwe
sequencing technieken daar en zijn de genoom sequence projecten toegenomen. Op dit
moment zijn er rond de 300.000 genomen gesequenced van organismen. Sommige delen
van de genomen zijn maar echt compleet. De rode staafjes zijn permanente drafts, dus dat
is het assembleren van het gesequencede
DNA zo goed als het kan, maar het zijn
vaak stukjes DNA die nog aan elkaar
geplakt moeten worden. en bij een
complete genome (blauwe staafjes) gaat
het echt over het assembleren van het
DNA en weten waar de overlappende
stukken liggen.
Het assembleren van data is heel lastig
door allerlei factoren en in de meeste
gevallen gebeurt dit dus niet (helemaal).
Het sequencing is begonnen met Fred Sanger, aangezien hij de Sanger Sequencing heeft
ontdekt. Deze Sanger method berust op twee belangrijke principes:
- DNA kan gescheiden worden op grootte (groot stukje DNA beweegt anders door een
matrix dan een klein stukje DNA);
- De elongatie van DNA kan chemisch geïnhibeerd worden (toevoegen stofjes zoals
colcemid of toevoegen nucleotiden zoals thymidine).
Bij de Sanger Sequencing wordt er aan iedere nucleotide een andere ‘stop’ geplakt,
genaamd ddNTP terminators. Door dit in lage concentraties toe te voegen, stopt de
elongatie van DNA af en toe. Hierdoor ontstaat er een soort patroon die bestaat uit
verschillende grootte van DNA en dit kan op een gel gezet worden. En door het omgekeerd
af te lezen, kon het DNA bepaald worden.
De Sanger Sequencing was stap 1 van de sequencing revolutie, stap 2 is de Lee Hood
automation. Lee Hood was heel goed in het automatiseren van zaken, en hij had bedacht
dat het sequencing geautomatiseerd kon worden door de scheiding te laten plaatsvinden in
een apparaat. De kleine stukjes DNA kwamen eerder uit het apparaat dan de grotere
stukken, en dit werd gedaan op een klein stukje capillair. De tweede stap van automatisering
was het toevoegen van verschillende kleuren fluorescente stoffen die aan de verschillende
nucleotiden werd geplakt.
, Zo kon het tegelijk gerund
worden door het capillair en
zo kon men kijken naar het
kleur licht dat werd
gefluoresceerd en dan weet
je welke nucleotide
passeert en dit vertaalde zich in een chromatogram. Samenvattend: een heel stuk DNA van
verschillende groottes met een verschillende fluorescente stops migreert door de capillair.
Deze wordt op volgorde gezet en vervolgens krijg je een sequentie read.
Voor het sequencen van het humane genoom waren er twee grote partijen die in competitie
met elkaar waren, namelijk een partij met universiteiten (en gekoppelde instanties) en de
Celera Corporation. Bij de universiteiten deden ze het sequencen door eerst een groot stuk
DNA in kleinere stukken te hakken. Deze kleine stukken werden per element in één bacterie
tot expressie gebracht, en in de bacterie werd dit kleine stuk DNA gesequenced en
vervolgens werd het allemaal in elkaar
gezet tot een groter stuk DNA. En deze
grotere stukken DNA werden aan elkaar
geplakt: hierachical shotgun method.
De Celera Corporation vond dit geen goede
manier en bedacht iets anders. Hierbij werd
het DNA van meerdere mensen geïsoleerd
en in één sample gestopt. Hier werd het
gefragmenteerd en vervolgens werd elk
stukje gesequenced door de Sanger
Methode. Dit wordt ook wel de whole
genome shotgun sequencing genoemd.
De “next-generation sequencing” begon bij Roche die de 454 ontwikkelde in 2005.
Vervolgens kwam Illumina met Solexa sequencing in 2006 en dit is nog steeds de
standaard voor sequencing.
Er zijn drie andere technieken die sinds die tijd zijn ontwikkeld, namelijk Ion Torrent die op
basis van pH werkt, pacific biosciences maakte packed bio reads wat veel langere reads
zijn ten opzichte van Illumina en dit geldt ook voor Oxford Nanopore Technologies (ONT),
waarbij er gebruikt gemaakt wordt van nanopore sequencing.
454 sequencing was de eerste techniek waarbij er één instrument werd gebruikt om heel
veel data te verkrijgen, dit is dus de eerste next-generation sequencer. De werking:
- Je begint met grote hoeveelheid DNA;
- Dit DNA wordt gefragmenteerd;
- Na de fragmentatie wordt aan allebei de kanten van de stukjes DNA een andere
adapter gezet;
- Vervolgens worden de stukjes DNA met
adapter in een oplossing gebracht samen
met kleine magnetische beads. Op deze
beads zit een complementaire adapter
waardoor één DNA stukje bindt aan bead;
- Na het binden vindt er op de bead PCR
plaats: emulsing PCR. Het ene stukje
DNA wordt dus geamplificeerd tot
duizenden kopieën (nodig om voldoende
signaal te maken in later stadium);
WEEK 5
Een belangrijk deel dat past bij sequencing is het Human Genome Project. Dit is een
aanleiding geweest voor bijna alle nieuwe generatie sequencing methoden die er op dit
moment beschikbaar zijn. Ergens in de jaren 90 wilden ze graag achter de sequentie van het
humane genoom komen, omdat ze zo dachten alle ziektes op te lossen (helaas niet zo
simpel).
Het Human Genome Project is begonnen met het bepalen van het humane genoom (op
chromosoom niveau) en welke stukken matchen waar. Vervolgens zijn er allerlei nieuwe
ontwikkelingen geweest, zijn we op het punt gekomen waar we nu zitten namelijk het
afronden van het HGP in 2004. En vanaf daar is de sequencing een heel groot onderdeel
geworden in de biologie en heeft een heel groot deel overgenomen.
Voor 2004 waren er vrij weinig genomen gesequenced en rond 2008/2010 waren de nieuwe
sequencing technieken daar en zijn de genoom sequence projecten toegenomen. Op dit
moment zijn er rond de 300.000 genomen gesequenced van organismen. Sommige delen
van de genomen zijn maar echt compleet. De rode staafjes zijn permanente drafts, dus dat
is het assembleren van het gesequencede
DNA zo goed als het kan, maar het zijn
vaak stukjes DNA die nog aan elkaar
geplakt moeten worden. en bij een
complete genome (blauwe staafjes) gaat
het echt over het assembleren van het
DNA en weten waar de overlappende
stukken liggen.
Het assembleren van data is heel lastig
door allerlei factoren en in de meeste
gevallen gebeurt dit dus niet (helemaal).
Het sequencing is begonnen met Fred Sanger, aangezien hij de Sanger Sequencing heeft
ontdekt. Deze Sanger method berust op twee belangrijke principes:
- DNA kan gescheiden worden op grootte (groot stukje DNA beweegt anders door een
matrix dan een klein stukje DNA);
- De elongatie van DNA kan chemisch geïnhibeerd worden (toevoegen stofjes zoals
colcemid of toevoegen nucleotiden zoals thymidine).
Bij de Sanger Sequencing wordt er aan iedere nucleotide een andere ‘stop’ geplakt,
genaamd ddNTP terminators. Door dit in lage concentraties toe te voegen, stopt de
elongatie van DNA af en toe. Hierdoor ontstaat er een soort patroon die bestaat uit
verschillende grootte van DNA en dit kan op een gel gezet worden. En door het omgekeerd
af te lezen, kon het DNA bepaald worden.
De Sanger Sequencing was stap 1 van de sequencing revolutie, stap 2 is de Lee Hood
automation. Lee Hood was heel goed in het automatiseren van zaken, en hij had bedacht
dat het sequencing geautomatiseerd kon worden door de scheiding te laten plaatsvinden in
een apparaat. De kleine stukjes DNA kwamen eerder uit het apparaat dan de grotere
stukken, en dit werd gedaan op een klein stukje capillair. De tweede stap van automatisering
was het toevoegen van verschillende kleuren fluorescente stoffen die aan de verschillende
nucleotiden werd geplakt.
, Zo kon het tegelijk gerund
worden door het capillair en
zo kon men kijken naar het
kleur licht dat werd
gefluoresceerd en dan weet
je welke nucleotide
passeert en dit vertaalde zich in een chromatogram. Samenvattend: een heel stuk DNA van
verschillende groottes met een verschillende fluorescente stops migreert door de capillair.
Deze wordt op volgorde gezet en vervolgens krijg je een sequentie read.
Voor het sequencen van het humane genoom waren er twee grote partijen die in competitie
met elkaar waren, namelijk een partij met universiteiten (en gekoppelde instanties) en de
Celera Corporation. Bij de universiteiten deden ze het sequencen door eerst een groot stuk
DNA in kleinere stukken te hakken. Deze kleine stukken werden per element in één bacterie
tot expressie gebracht, en in de bacterie werd dit kleine stuk DNA gesequenced en
vervolgens werd het allemaal in elkaar
gezet tot een groter stuk DNA. En deze
grotere stukken DNA werden aan elkaar
geplakt: hierachical shotgun method.
De Celera Corporation vond dit geen goede
manier en bedacht iets anders. Hierbij werd
het DNA van meerdere mensen geïsoleerd
en in één sample gestopt. Hier werd het
gefragmenteerd en vervolgens werd elk
stukje gesequenced door de Sanger
Methode. Dit wordt ook wel de whole
genome shotgun sequencing genoemd.
De “next-generation sequencing” begon bij Roche die de 454 ontwikkelde in 2005.
Vervolgens kwam Illumina met Solexa sequencing in 2006 en dit is nog steeds de
standaard voor sequencing.
Er zijn drie andere technieken die sinds die tijd zijn ontwikkeld, namelijk Ion Torrent die op
basis van pH werkt, pacific biosciences maakte packed bio reads wat veel langere reads
zijn ten opzichte van Illumina en dit geldt ook voor Oxford Nanopore Technologies (ONT),
waarbij er gebruikt gemaakt wordt van nanopore sequencing.
454 sequencing was de eerste techniek waarbij er één instrument werd gebruikt om heel
veel data te verkrijgen, dit is dus de eerste next-generation sequencer. De werking:
- Je begint met grote hoeveelheid DNA;
- Dit DNA wordt gefragmenteerd;
- Na de fragmentatie wordt aan allebei de kanten van de stukjes DNA een andere
adapter gezet;
- Vervolgens worden de stukjes DNA met
adapter in een oplossing gebracht samen
met kleine magnetische beads. Op deze
beads zit een complementaire adapter
waardoor één DNA stukje bindt aan bead;
- Na het binden vindt er op de bead PCR
plaats: emulsing PCR. Het ene stukje
DNA wordt dus geamplificeerd tot
duizenden kopieën (nodig om voldoende
signaal te maken in later stadium);
