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Cu rs o: Numero _ _ __
2° Exame de Engenh a ria Gen etica
5 de Fevere iro de 2021; Dura<;:ao- 2h
Muitas bacterias patogenicas, incluindo as especies de Pseudomonas , uti liz am 0 sistema de secre<;:ao do
tipo III (T388) para entrega r prote inas efectoras as celulas an imais, causando patogenicidade. Os genes
que codificam para 0 sistem a T 38S e seus efectores sao reprim idos em meio rico em nutrientes, mas sao
rapidame nte induzidos na presen <;:a de celulas do hospedeiro ou quando 0 crescimento e efectuado num
meio de cultura pobre em nutrien tes (MM). Para melhor compreender a reg ula<;:ao da exp ressao dos genes
que codificam para 0 sistema T38 S, os autores utilizaram Pseudomonas aeruginosa com o modele
bacteriano para infec<;:ao da linh a celular de pulmao ATT .
1- A prirnei ra experien ci a fo i con struir um siste ma re porter para visualiza<;:ao da express ao dos genes
que codificam para 0 sistema T 38S . Para isso, 0 promotor do gene avr (um gene do sistema T3SS) fo i
usado ern conjunto com 0 gene reporter gfp qu e codi fica a proteina de fluorescencia verd e.
a) Tendo um vector replicativo com um local de clonagem multipla a montante do gene gfp, refira todas
as eta pas da clo nagem do Pro r.r9tor do gene avr (avrPtr) e a sua posterior introdu<;:ao em P.
aen!ginosa . (1,0 v alor) I) urt~~"
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b) Com o ~em os auto~ te~r se 0 p~mideo construido em 1a) e um reporte adequado para inferir
I
sobre a expressao dos genes do sistema T38S? Indique as cond i<;:6es de crescimento, o(s)
controlo(s) e os res ultado s esperados nesta expe riencia . (1,0 v alor)
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, 2- Agora que os autores tem uma estirpe de P. aeruginosa com um sistema reporter, a proxima etapa
foi construir uma biblioteca de mutantes por acc;:ao de um transposao e rastrear para mutantes com
um a diminu ic;:ao da induc;:ao do reporter GFP.
• a) Ate ndendo ao o bj ectiv ~, qua l a importancia de usarem um tran sposao ? (0,5 valo res) I .
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c) Considerando que na experiencia de mutagenese obtiveram 5000 colon ias, como sera feito 0
rastreio dos mutantes de interesse? (0,5 valores)
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transposao . Proponha uma estrategia para obtenc;:ao dessa info rmac;:ao, indicando as principais
etapas da tecnica escolhida (1,5 valo res)
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