College 10; 16-12 (H8)
Primaire cellen:
- Geïsoleerd uit weefsels; de cellen zijn gehecht aan de extracellulaire matrix dus deze moet
worden afgebroken om de cellen los te krijgen uit het weefsel. De cellen worden losgemaakt
door enzymen (trypsine en collogenase) en EDTA (calcium bindend molecuul).
- Cellen kunnen vaak maar een beperkt aantal keer delen (passages), de telomeer raakt op.
- Veel cellen groeien en delen zich alleen als ze zich op een oppervlakte kunnen hechten (cell-
dish, vaak gecoat met polylysine; collageen) en kun je dus niet in een vloeistof kweken.
- Celkweekmedium bevat complexe mix van onder andere groeifactoren
Manieren om cellen te isoleren:
- Microdissection; bepaalde cellen worden
uit een weefsel gehaald. Met behulp van
laserstralen wordt een stukje weefsel, dat
kankercellen bevat, geïsoleerd. Dit heeft als
resultaat dat er een mengsel van cellen
geïsoleerd wordt waarbij de celtypes dus
verschillen en de bijbehorende functies
ook.
- Fluorescence-Activated Cell storting
(FACS); de cellen in een suspensie worden door een hele
dunne naald gehaald. Deze vloeistofstroom is zo klein dat
er telkens maar één cel doorheen kan; één druppel bevat
dus één cel. Met een laser kan deze druppel op twee
manieren worden bekeken:
1. het laserlicht wordt door de cel in de druppel
gescatterd (verstrooid) (grote cel, veel scattering en
andersom).
2. Met behulp van fluorescente antilichamen die kijken of
er bepaalde groepen aan de buitenkant (receptoren)
van de cel aanwezig zijn. Vaak worden er meerdere
antilichamen toegevoegd die elk hun eigen
fluorescente groep hebben en aan een specifieke
receptor binden. Met de laser kan dan
gekeken worden welke kleuren een cel
bevat zodat het duidelijk wordt welke
receptoren het heeft. Op basis van de
scattering of de fluorescentie kan er een
lading aan de druppel gegeven worden;
zo kunnen de cellen gescheden worden. Zeer snel proces; analyseert
20.000 cellen per seconde. Populaties van cellen kunnen makkelijk worden
onderscheden; elk puntje in de afbeelding is een cel. Zo is duidelijk te zien
dat de neutrofielen groene fluorescentie hebben, de monocyten rode en
de lymfocyten geen.
Cellen kunnen maar een beperkt aantal keer delen, maar wanneer ze gesorteerd zijn, is het te
bedoeling dat je ze door kunt kweken. Oplossingen hiervoor zijn:
1. Replicative cell senescense (probleem van beperkte deling); een plasmide in de cel
aanbrengen wat codeert voor recombinant telomerase waardoor de enzymactiviteit als het
ware weer aangezet wordt en de cel verder kan delen; dit geeft onsterfelijke cellen
, 2. Check-point mechanismen (kunnen ervoor zorgen
dat de cellijn niet verder doorgroeit); gebruik
maken van tumorcellijnen waarbij de check-points
zijn uitgeschakeld.
Cellen kunnen in principe onbeperkt delen en in vloeibare
stikstof (-196 ◦C) bewaard worden.
Er zijn veel verschillende cellijnen bekend; merendeel
tumorcellen die een andere oorsprong hebben en hiervan
nog wel degelijk de eigenschappen hebben.
Embryonale stamcellen die geïsoleerd zijn uit een embryo; zijn nog
niet gedifferentieerd en bevatten nog veel telomerase; zijn makkelijk in
kweek te houden. Stamcellen kunnen nog differentiëren naar elk
gewenst celtype. Oorspronkelijk werden deze cellen alleen uit
embryo’s gehaald maar tegenwoordig kunnen ze ook uit volwassen
weefsels worden geïsoleerd. Een reeds gedifferentieerde cel kan zelfs
weer teruggebracht worden naar een stamcel.
Met Somatic nuclear transplantation kun je ervoor zorgen dat de
stamcellen genetisch identiek zijn met de patiënt.
Dit begint met een niet bevruchte eicel waar de
kern uit wordt geïsoleerd. Hierin wordt de kern
geplaatst uit een andere cel (bijvoorbeeld een
somatische (volwassen) cel). Soms is het dan zo dat
de cel dan bevrucht is en uitgroeit tot een embryo.
De genetische informatie van de stamcel en
uiteindelijk het embryo word dus bepaald door de
kern die je uit de somatische cel hebt gehaald.
Hiermee kun je:
- Reproductive cloning; er worden de hele
tijd organismen gemaakt met dezelfde genetische achtergrond.
- Therapeutic cloning; er kunnen ziekte-specifieke stamcellen ontwikkeld worden
Klonen:
- De meeste klonen sterven voortijdig (inefficiënt)
- Geen 100% klonen mogelijk (mitochondrieel DNA
verschilt per organisme)
- Klonen vertonen een groot aantal genetische
effecten
- Genen hebben een afwijkend expressie-patroon
Vorm van kloneren op celniveau dat wel heel effectief is;
monoklonale antilichamen uit hybridoma cellijnen. Een
proefdier wordt geïnjecteerd met het eiwit waartegen je
een antilichaam wilt maken. Deze antilichamen worden
gemaakt in de B lymfocyten; deze maken elk hun
specifieke eigen antilichaam. Maar wanneer je veel
van deze antilichamen wilt, zou je veel muizen
nodig hebben. Ook verkrijg je uit het bloed van de
muis verschillende specifieke antilichamen en
antilichamen tegen andere eiwitten. Om dit op te
,lossen kun je de B lymfocyten van de muis isoleren; deze kun je laten
fuseren met een tumorcellijn van B lymfocyten uit de muis. Dit resulteert
in hybridoma cellen die zowel het DNA van
de antilichaam producerende B lymfocyt als
het DNA van de tumorcellijn bevat. Krijgt dus
een cel met beide kernen; deze kernen
kunnen met elkaar fuseren. Er is nu alleen nog steeds een mengsel van
de verschillende antilichamen, maar deze kun je verdunnen en selecteren
op een cel die een specifiek antilichaam produceert.
Voor bepaald onderzoek is het ook handig om organellen te isoleren;
door middel van cel fractioning. Onderdelen van de cel worden
gescheden door centrifugatie waardoor het membraan kapot wordt
gemaakt. Door bij verschillende snelheden te centrifugeren, kun je
verschillende delen van de cel isoleren. Bij sloom isoleren verkrijg je de
grote fragmenten van de cel. Hoe sneller je centrifugeert, hoe kleinere
fragmenten je verkrijgt. Dus scheiding op grootte. Kunt ook gebruik
maken van een gradiënt met verschillende dichtheden. Hierdoor zakken
de fragmenten met een grote dichtheid meer naar de bodem en blijven
die met een lichte dichtheid bovenin hangen.
Herhaling van biochemie:
H3 Exploring proteins and
proteomes
Scheidingsmethoden voor de
zuivering (purificatie) van eiwitten:
1) Het homogeniseren van de cel;
het kapot maken van het
celmembraan zodat de eiwitten de cel kunnen verlaten.
2) Centrifugeren; het scheiden van mengsels waarbij het
‘zwaardere’ materiaal zich beneden bevindt en het
‘lichtere’ erboven. De supernatant die na de eerste
centrifugatie ontstaat, wordt opnieuw gecentrifugeerd
met een hogere kracht waardoor er weer een nieuwe
supernatant, bestaande uit nog steeds erg veel
verschillende eiwitten, met een lagere dichtheid
ontstaat. Dit noem je differentiële centrifugatie.
3) Scheiden van de eiwitten:
• Salting out; het effect dat de meeste eiwitten minder oplosbaar zijn
bij hoge zout concentraties. Het verschilt per eiwit bij welke
zoutconcentratie het neerslaat.
• Dialyse; Scheiding op basis van grootte; de kleine eiwitten
diffunderen door het celmembraan, de grotere eiwitten blijven
achter in de dialysis bag. Wordt vooral gebruikt om bijvoorbeeld
zout of andere kleine moleculen te verwijderen, niet om duidelijk
onderscheid tussen eiwitten te maken.
• Gelfiltratie chromatografie; ook op basis van
grootte; de sample wordt aan de bovenkant
van de kolom aangebracht. In de kolom
bevinden zich poreuze ‘kralen’ gemaakt van
een sterk gehydrateerd polymeer
(polyacrylamide). Kleine eiwitten kunnen deze
, betreden en blijven dus boven in de kolom hangen (zitten in en
tussen de kralen), grotere kunnen dit niet; zij zakken verder naar
beneden (alleen buiten de kralen). De grote eiwitten bevinden zich
sneller beneden.
• Ion-exchange chromatografie; Scheiding op basis van
lading; in de kolom bevinden zich geladen ‘kralen’, wanneer deze
negatief geladen (anion) zijn zullen de positief geladen (kation)
eiwitten binden en de negatief geladen eiwitten de kolom snel
passeren. Vervolgens wordt het gebonden eiwit vrijgelaten door
het verhogen van de concentratie zout in de oplossing; de
zoutionen ‘vechten’ dan met de eiwitten om zich aan de kralen te
binden.
• Affiniteit chromatografie; ook deze kolom bevat kralen
waar eiwitten met een hoge affiniteit voor speciale groepen zich
aan binden. Eiwitten met een lage affiniteit voor deze groepen
‘lopen’ snel door de kolom heen. Vervolgens wordt deze binding
weer verbroken door het verhogen van de concentratie van de
bepaalde groep waar het eiwit de affiniteit voor heeft (op de
afbeelding glucose). Dit glucose vervangt dan de glucose die gebonden is aan de
kraal waardoor het eiwit loskomt.
• High-perfomance liquid chromatografie (HPLC); betere methode dan de
voorgaande waarbij de eiwitten goed gescheiden worden. het is
vloeistofchromatografie waarbij de eluens (loopvloeistof met de eiwitten) onder
hoge druk door een sterk gepakte kolom wordt gepompt. Bij HPLC is de kolom polair en
de mobiele fase apolair.
Daardoor hebben
polaire componenten
een sterkere interactie
met de stationaire fase
dan apolaire
componenten. Apolaire
componenten komen
dus sneller van de
kolom af dan polaire
componenten.
Methoden om te kijken of de eiwitten zuiver zijn en wat voor
eiwitten het zijn (analyse):
• Gel electrophoresis; een molecuul met een netto
lading beweegt zich over een elektrisch veld.
Het molecuul wordt door een elektrische
kracht naar de andere kant verplaatst; van de
negatieve naar de positieve elektrode. Een
soort van zeef met een poreuze gel
(polyacrylamide zie afbeelding) waar kleinere
moleculen sneller doorheen lopen dan grote.
Eiwitten kunnen door electrophoresis in gel op
basis van grootte gescheiden worden. De mix
eiwitten wordt eerst opgelost in SDS (sodium
dodecyl sulfate) en daarna in het apparaat
gebracht. SDS PAGE heeft denaturerende condities; het vernietigt niet covalente
Primaire cellen:
- Geïsoleerd uit weefsels; de cellen zijn gehecht aan de extracellulaire matrix dus deze moet
worden afgebroken om de cellen los te krijgen uit het weefsel. De cellen worden losgemaakt
door enzymen (trypsine en collogenase) en EDTA (calcium bindend molecuul).
- Cellen kunnen vaak maar een beperkt aantal keer delen (passages), de telomeer raakt op.
- Veel cellen groeien en delen zich alleen als ze zich op een oppervlakte kunnen hechten (cell-
dish, vaak gecoat met polylysine; collageen) en kun je dus niet in een vloeistof kweken.
- Celkweekmedium bevat complexe mix van onder andere groeifactoren
Manieren om cellen te isoleren:
- Microdissection; bepaalde cellen worden
uit een weefsel gehaald. Met behulp van
laserstralen wordt een stukje weefsel, dat
kankercellen bevat, geïsoleerd. Dit heeft als
resultaat dat er een mengsel van cellen
geïsoleerd wordt waarbij de celtypes dus
verschillen en de bijbehorende functies
ook.
- Fluorescence-Activated Cell storting
(FACS); de cellen in een suspensie worden door een hele
dunne naald gehaald. Deze vloeistofstroom is zo klein dat
er telkens maar één cel doorheen kan; één druppel bevat
dus één cel. Met een laser kan deze druppel op twee
manieren worden bekeken:
1. het laserlicht wordt door de cel in de druppel
gescatterd (verstrooid) (grote cel, veel scattering en
andersom).
2. Met behulp van fluorescente antilichamen die kijken of
er bepaalde groepen aan de buitenkant (receptoren)
van de cel aanwezig zijn. Vaak worden er meerdere
antilichamen toegevoegd die elk hun eigen
fluorescente groep hebben en aan een specifieke
receptor binden. Met de laser kan dan
gekeken worden welke kleuren een cel
bevat zodat het duidelijk wordt welke
receptoren het heeft. Op basis van de
scattering of de fluorescentie kan er een
lading aan de druppel gegeven worden;
zo kunnen de cellen gescheden worden. Zeer snel proces; analyseert
20.000 cellen per seconde. Populaties van cellen kunnen makkelijk worden
onderscheden; elk puntje in de afbeelding is een cel. Zo is duidelijk te zien
dat de neutrofielen groene fluorescentie hebben, de monocyten rode en
de lymfocyten geen.
Cellen kunnen maar een beperkt aantal keer delen, maar wanneer ze gesorteerd zijn, is het te
bedoeling dat je ze door kunt kweken. Oplossingen hiervoor zijn:
1. Replicative cell senescense (probleem van beperkte deling); een plasmide in de cel
aanbrengen wat codeert voor recombinant telomerase waardoor de enzymactiviteit als het
ware weer aangezet wordt en de cel verder kan delen; dit geeft onsterfelijke cellen
, 2. Check-point mechanismen (kunnen ervoor zorgen
dat de cellijn niet verder doorgroeit); gebruik
maken van tumorcellijnen waarbij de check-points
zijn uitgeschakeld.
Cellen kunnen in principe onbeperkt delen en in vloeibare
stikstof (-196 ◦C) bewaard worden.
Er zijn veel verschillende cellijnen bekend; merendeel
tumorcellen die een andere oorsprong hebben en hiervan
nog wel degelijk de eigenschappen hebben.
Embryonale stamcellen die geïsoleerd zijn uit een embryo; zijn nog
niet gedifferentieerd en bevatten nog veel telomerase; zijn makkelijk in
kweek te houden. Stamcellen kunnen nog differentiëren naar elk
gewenst celtype. Oorspronkelijk werden deze cellen alleen uit
embryo’s gehaald maar tegenwoordig kunnen ze ook uit volwassen
weefsels worden geïsoleerd. Een reeds gedifferentieerde cel kan zelfs
weer teruggebracht worden naar een stamcel.
Met Somatic nuclear transplantation kun je ervoor zorgen dat de
stamcellen genetisch identiek zijn met de patiënt.
Dit begint met een niet bevruchte eicel waar de
kern uit wordt geïsoleerd. Hierin wordt de kern
geplaatst uit een andere cel (bijvoorbeeld een
somatische (volwassen) cel). Soms is het dan zo dat
de cel dan bevrucht is en uitgroeit tot een embryo.
De genetische informatie van de stamcel en
uiteindelijk het embryo word dus bepaald door de
kern die je uit de somatische cel hebt gehaald.
Hiermee kun je:
- Reproductive cloning; er worden de hele
tijd organismen gemaakt met dezelfde genetische achtergrond.
- Therapeutic cloning; er kunnen ziekte-specifieke stamcellen ontwikkeld worden
Klonen:
- De meeste klonen sterven voortijdig (inefficiënt)
- Geen 100% klonen mogelijk (mitochondrieel DNA
verschilt per organisme)
- Klonen vertonen een groot aantal genetische
effecten
- Genen hebben een afwijkend expressie-patroon
Vorm van kloneren op celniveau dat wel heel effectief is;
monoklonale antilichamen uit hybridoma cellijnen. Een
proefdier wordt geïnjecteerd met het eiwit waartegen je
een antilichaam wilt maken. Deze antilichamen worden
gemaakt in de B lymfocyten; deze maken elk hun
specifieke eigen antilichaam. Maar wanneer je veel
van deze antilichamen wilt, zou je veel muizen
nodig hebben. Ook verkrijg je uit het bloed van de
muis verschillende specifieke antilichamen en
antilichamen tegen andere eiwitten. Om dit op te
,lossen kun je de B lymfocyten van de muis isoleren; deze kun je laten
fuseren met een tumorcellijn van B lymfocyten uit de muis. Dit resulteert
in hybridoma cellen die zowel het DNA van
de antilichaam producerende B lymfocyt als
het DNA van de tumorcellijn bevat. Krijgt dus
een cel met beide kernen; deze kernen
kunnen met elkaar fuseren. Er is nu alleen nog steeds een mengsel van
de verschillende antilichamen, maar deze kun je verdunnen en selecteren
op een cel die een specifiek antilichaam produceert.
Voor bepaald onderzoek is het ook handig om organellen te isoleren;
door middel van cel fractioning. Onderdelen van de cel worden
gescheden door centrifugatie waardoor het membraan kapot wordt
gemaakt. Door bij verschillende snelheden te centrifugeren, kun je
verschillende delen van de cel isoleren. Bij sloom isoleren verkrijg je de
grote fragmenten van de cel. Hoe sneller je centrifugeert, hoe kleinere
fragmenten je verkrijgt. Dus scheiding op grootte. Kunt ook gebruik
maken van een gradiënt met verschillende dichtheden. Hierdoor zakken
de fragmenten met een grote dichtheid meer naar de bodem en blijven
die met een lichte dichtheid bovenin hangen.
Herhaling van biochemie:
H3 Exploring proteins and
proteomes
Scheidingsmethoden voor de
zuivering (purificatie) van eiwitten:
1) Het homogeniseren van de cel;
het kapot maken van het
celmembraan zodat de eiwitten de cel kunnen verlaten.
2) Centrifugeren; het scheiden van mengsels waarbij het
‘zwaardere’ materiaal zich beneden bevindt en het
‘lichtere’ erboven. De supernatant die na de eerste
centrifugatie ontstaat, wordt opnieuw gecentrifugeerd
met een hogere kracht waardoor er weer een nieuwe
supernatant, bestaande uit nog steeds erg veel
verschillende eiwitten, met een lagere dichtheid
ontstaat. Dit noem je differentiële centrifugatie.
3) Scheiden van de eiwitten:
• Salting out; het effect dat de meeste eiwitten minder oplosbaar zijn
bij hoge zout concentraties. Het verschilt per eiwit bij welke
zoutconcentratie het neerslaat.
• Dialyse; Scheiding op basis van grootte; de kleine eiwitten
diffunderen door het celmembraan, de grotere eiwitten blijven
achter in de dialysis bag. Wordt vooral gebruikt om bijvoorbeeld
zout of andere kleine moleculen te verwijderen, niet om duidelijk
onderscheid tussen eiwitten te maken.
• Gelfiltratie chromatografie; ook op basis van
grootte; de sample wordt aan de bovenkant
van de kolom aangebracht. In de kolom
bevinden zich poreuze ‘kralen’ gemaakt van
een sterk gehydrateerd polymeer
(polyacrylamide). Kleine eiwitten kunnen deze
, betreden en blijven dus boven in de kolom hangen (zitten in en
tussen de kralen), grotere kunnen dit niet; zij zakken verder naar
beneden (alleen buiten de kralen). De grote eiwitten bevinden zich
sneller beneden.
• Ion-exchange chromatografie; Scheiding op basis van
lading; in de kolom bevinden zich geladen ‘kralen’, wanneer deze
negatief geladen (anion) zijn zullen de positief geladen (kation)
eiwitten binden en de negatief geladen eiwitten de kolom snel
passeren. Vervolgens wordt het gebonden eiwit vrijgelaten door
het verhogen van de concentratie zout in de oplossing; de
zoutionen ‘vechten’ dan met de eiwitten om zich aan de kralen te
binden.
• Affiniteit chromatografie; ook deze kolom bevat kralen
waar eiwitten met een hoge affiniteit voor speciale groepen zich
aan binden. Eiwitten met een lage affiniteit voor deze groepen
‘lopen’ snel door de kolom heen. Vervolgens wordt deze binding
weer verbroken door het verhogen van de concentratie van de
bepaalde groep waar het eiwit de affiniteit voor heeft (op de
afbeelding glucose). Dit glucose vervangt dan de glucose die gebonden is aan de
kraal waardoor het eiwit loskomt.
• High-perfomance liquid chromatografie (HPLC); betere methode dan de
voorgaande waarbij de eiwitten goed gescheiden worden. het is
vloeistofchromatografie waarbij de eluens (loopvloeistof met de eiwitten) onder
hoge druk door een sterk gepakte kolom wordt gepompt. Bij HPLC is de kolom polair en
de mobiele fase apolair.
Daardoor hebben
polaire componenten
een sterkere interactie
met de stationaire fase
dan apolaire
componenten. Apolaire
componenten komen
dus sneller van de
kolom af dan polaire
componenten.
Methoden om te kijken of de eiwitten zuiver zijn en wat voor
eiwitten het zijn (analyse):
• Gel electrophoresis; een molecuul met een netto
lading beweegt zich over een elektrisch veld.
Het molecuul wordt door een elektrische
kracht naar de andere kant verplaatst; van de
negatieve naar de positieve elektrode. Een
soort van zeef met een poreuze gel
(polyacrylamide zie afbeelding) waar kleinere
moleculen sneller doorheen lopen dan grote.
Eiwitten kunnen door electrophoresis in gel op
basis van grootte gescheiden worden. De mix
eiwitten wordt eerst opgelost in SDS (sodium
dodecyl sulfate) en daarna in het apparaat
gebracht. SDS PAGE heeft denaturerende condities; het vernietigt niet covalente
