College 4: diagnostische microbiologie
Behandelde onderwerpen in dit college:
- diagnostische microbiologie
- laboratorium methoden
- bacterie identificatie
- immunologische methoden
- laboratorium onderzoek voor toepassing antimicrobiële therapie
- laboratorium isolatie en identificatie van virussen
- diagnose van schimmel infecties
Stappen diagnostische microbiologie:
Studie infectie-verdachte patiënt monster maken diagnose stellen therapie schrijven
Doel: Interactieve mondhygiëniste is handig voor de keuze om monsters te nemen zodat
eerder diagnoses gesteld kunnen worden
1. patiënt (met een gek verschijnsel zoals misschien een infectie)
2. vraagstelling; je wilt er meer van weten
3. kweek opname; speciale manier zodat het niet dood gaat.
4. transport kweek; als je het verkeerd buffert zijn de bacteriën dood.
5. laboratorium onderzoek
6. data verzamelen
7. interpretatie resultaten (data)
8. diagnose en behandeling van patiënt (antibiotica, therapie)
Diagnostische microbiologie = houdt zich bezig met kweken en infecties
Vroeger maakte je een kweekje, nu kun je ook moleculaire technieken gebruiken.
- Kweek: monster afname, kweek maken, meerdere koloniën laten groeien, DNA isolatie, PCR
(fragment weergave DNA), knippen dna met restrictie enzym, scheiden op grootte met
running; fingerprint zodat je bacterie kan identificeren
- Moleculaire techniek: DNA gelijk opslaan uit monster (zonder te kweken), kloneren in
bacteriën (ecolie) stoppen zodat zij stoffen maken en daarna die stoffen bekijken zodat je een
fragment kunt maken en op een gel kunt runnen
Nadeel kweek tov moleculaire techniek: je raakt moleculen kwijt, gebeurt niet met nieuwe
technieken en je kunt niet alles kweken
Recombinant DNA technologie: MOLECULAIRE TECHNIEKEN
= identificatie in laboratorium van micro-organismen op basis van het DNA/RNA sequentie.
Gebeurt door:
Restrictie enzymen (endonucleases) = enzymen die DNA knippen bij een bepaalde sequentie,
afkomstig van enzymen (= rij aminozuren in bepaalde volgorde. Iedere bacterie heeft een
eigen restrictie enzym.
LET OP: er zijn twee manieren van knippen: Blunded end kan niet meer geplakt worden dus
alleen sticky ends (overhangende) worden in het lab gebruikt omdat de complementaire
, sequentie de overhang herkent en bij blunded kan dit dus niet. Blunded end is dat het rijtje
peptiden goed zijn ‘’afgeknipt’’ en sticky ends is dat het rijtje ‘’overhangt’’.
VERSCHILLENDE SOORTEN PROCESSEN
- proces kloneren: HAALT DNA MET GEWILDE GEN UIT ORGANISME KNIPT GENOOM
KAPOT PLAKT (dmv dna ligase) HET IN ANDERE ORGANISMEN HUN PLASMIDES (MET EEN
SINGLE STRENG) WORDT WEER EEN NIEUW GENOOM.
Restrictie enzymen zijn speciaal aanwezig in bacteriën zodat ze andere organismen hun
genoom kapot kunnen maken (en hun eigen)
- Proces hybridisatie (binding van DNA-strengen verklaren)
Probe = korte DNA sequentie (aantal nucleotides op een rijtje); deze kunnen radio actief of
fluorescent gelabeld zijn (om een bepaald merkje te geven). deze twee soorten kunnen
handig zijn voor het identificeren van DNA of RNA fragmenten of je weet of een bepaalde
virus/bacterie in een kweek zit (door middel van hybridisatie)
Als je sequencies uit elkaar hebt geknipt, laat je ze runnen op een gel. Je verplaatst de
gerunde delen naar een ander soort medium, laat de probes er op los en kijkt waar die
hybridiseren. Als je ze onder een x-ray houdt kun je de delen zien die hechten aan de probes
en die delen (die wil je graag) kun je er uit snijden zodat je die kunt gebruiken.
- Restrictie enzym analyse; begint met monster DNA wordt er uitgehaald knippen van
DNA met restrictie endonucleases runnen van elektroforese gel elk organismen heeft zijn
eigen uniek patroon (zoals een genetische vinger afdruk)
- Kleine fragmenten gaan het snelst door de gel, grote fragmenten minder snel. Als je de
fragmenten laat ‘lopen’ en de onderste zijn dan de kleinere omdat ze het snelst naar onder
zijn gezakt hierdoor ontstaat een bepaald patroon. (= dit is runnen)
- Techniek sequencing = bepalen genetische sequentie (=volgorde)
Sanger strategie:
1. Uit elkaar halen van 2 strengen (door verhitting)
2. primer koppelen aan de streng (begint bij de 3’)
3. Losse nucleotiden in buizen houden en erbij loslaten zodat nucleotides aan de streng
wordt gekoppeld.
4. Stoppen van koppelen nucleotides bij een H-groep
5. proces steeds opnieuw herhalen voor meerdere stukjes
6. stukjes laten runnen op de gel zodat je weet welk stukje wat is
BELANGRIJK: Als een OH groep aan een nucleotide zit kunnen nieuwe nucleotides worden
gebonden, als alleen een H-atoom aanwezig is wordt de keten gestopt en kunnen geen
nucleotides meer gebonden worden. Afhankelijk van de kleuren kun je de sequentie aflezen,
elke T, G, A en C krijgen een andere kleur. Hierdoor kun je èn de volgorde èn de lengte van de
streng zien.
Hierdoor moet wel een bepaalde verhouding enzym tegenover het aantal nucleotides worden
gebruikt, anders krijg je heel veel korte nucleotide ketens. Je kunt bij de nucleotides met een
H-atoom er aan (stopcodons) kleuren/fluoriseren.
Behandelde onderwerpen in dit college:
- diagnostische microbiologie
- laboratorium methoden
- bacterie identificatie
- immunologische methoden
- laboratorium onderzoek voor toepassing antimicrobiële therapie
- laboratorium isolatie en identificatie van virussen
- diagnose van schimmel infecties
Stappen diagnostische microbiologie:
Studie infectie-verdachte patiënt monster maken diagnose stellen therapie schrijven
Doel: Interactieve mondhygiëniste is handig voor de keuze om monsters te nemen zodat
eerder diagnoses gesteld kunnen worden
1. patiënt (met een gek verschijnsel zoals misschien een infectie)
2. vraagstelling; je wilt er meer van weten
3. kweek opname; speciale manier zodat het niet dood gaat.
4. transport kweek; als je het verkeerd buffert zijn de bacteriën dood.
5. laboratorium onderzoek
6. data verzamelen
7. interpretatie resultaten (data)
8. diagnose en behandeling van patiënt (antibiotica, therapie)
Diagnostische microbiologie = houdt zich bezig met kweken en infecties
Vroeger maakte je een kweekje, nu kun je ook moleculaire technieken gebruiken.
- Kweek: monster afname, kweek maken, meerdere koloniën laten groeien, DNA isolatie, PCR
(fragment weergave DNA), knippen dna met restrictie enzym, scheiden op grootte met
running; fingerprint zodat je bacterie kan identificeren
- Moleculaire techniek: DNA gelijk opslaan uit monster (zonder te kweken), kloneren in
bacteriën (ecolie) stoppen zodat zij stoffen maken en daarna die stoffen bekijken zodat je een
fragment kunt maken en op een gel kunt runnen
Nadeel kweek tov moleculaire techniek: je raakt moleculen kwijt, gebeurt niet met nieuwe
technieken en je kunt niet alles kweken
Recombinant DNA technologie: MOLECULAIRE TECHNIEKEN
= identificatie in laboratorium van micro-organismen op basis van het DNA/RNA sequentie.
Gebeurt door:
Restrictie enzymen (endonucleases) = enzymen die DNA knippen bij een bepaalde sequentie,
afkomstig van enzymen (= rij aminozuren in bepaalde volgorde. Iedere bacterie heeft een
eigen restrictie enzym.
LET OP: er zijn twee manieren van knippen: Blunded end kan niet meer geplakt worden dus
alleen sticky ends (overhangende) worden in het lab gebruikt omdat de complementaire
, sequentie de overhang herkent en bij blunded kan dit dus niet. Blunded end is dat het rijtje
peptiden goed zijn ‘’afgeknipt’’ en sticky ends is dat het rijtje ‘’overhangt’’.
VERSCHILLENDE SOORTEN PROCESSEN
- proces kloneren: HAALT DNA MET GEWILDE GEN UIT ORGANISME KNIPT GENOOM
KAPOT PLAKT (dmv dna ligase) HET IN ANDERE ORGANISMEN HUN PLASMIDES (MET EEN
SINGLE STRENG) WORDT WEER EEN NIEUW GENOOM.
Restrictie enzymen zijn speciaal aanwezig in bacteriën zodat ze andere organismen hun
genoom kapot kunnen maken (en hun eigen)
- Proces hybridisatie (binding van DNA-strengen verklaren)
Probe = korte DNA sequentie (aantal nucleotides op een rijtje); deze kunnen radio actief of
fluorescent gelabeld zijn (om een bepaald merkje te geven). deze twee soorten kunnen
handig zijn voor het identificeren van DNA of RNA fragmenten of je weet of een bepaalde
virus/bacterie in een kweek zit (door middel van hybridisatie)
Als je sequencies uit elkaar hebt geknipt, laat je ze runnen op een gel. Je verplaatst de
gerunde delen naar een ander soort medium, laat de probes er op los en kijkt waar die
hybridiseren. Als je ze onder een x-ray houdt kun je de delen zien die hechten aan de probes
en die delen (die wil je graag) kun je er uit snijden zodat je die kunt gebruiken.
- Restrictie enzym analyse; begint met monster DNA wordt er uitgehaald knippen van
DNA met restrictie endonucleases runnen van elektroforese gel elk organismen heeft zijn
eigen uniek patroon (zoals een genetische vinger afdruk)
- Kleine fragmenten gaan het snelst door de gel, grote fragmenten minder snel. Als je de
fragmenten laat ‘lopen’ en de onderste zijn dan de kleinere omdat ze het snelst naar onder
zijn gezakt hierdoor ontstaat een bepaald patroon. (= dit is runnen)
- Techniek sequencing = bepalen genetische sequentie (=volgorde)
Sanger strategie:
1. Uit elkaar halen van 2 strengen (door verhitting)
2. primer koppelen aan de streng (begint bij de 3’)
3. Losse nucleotiden in buizen houden en erbij loslaten zodat nucleotides aan de streng
wordt gekoppeld.
4. Stoppen van koppelen nucleotides bij een H-groep
5. proces steeds opnieuw herhalen voor meerdere stukjes
6. stukjes laten runnen op de gel zodat je weet welk stukje wat is
BELANGRIJK: Als een OH groep aan een nucleotide zit kunnen nieuwe nucleotides worden
gebonden, als alleen een H-atoom aanwezig is wordt de keten gestopt en kunnen geen
nucleotides meer gebonden worden. Afhankelijk van de kleuren kun je de sequentie aflezen,
elke T, G, A en C krijgen een andere kleur. Hierdoor kun je èn de volgorde èn de lengte van de
streng zien.
Hierdoor moet wel een bepaalde verhouding enzym tegenover het aantal nucleotides worden
gebruikt, anders krijg je heel veel korte nucleotide ketens. Je kunt bij de nucleotides met een
H-atoom er aan (stopcodons) kleuren/fluoriseren.
