Samenvatting Biomoleculaire
Chemie Deel 2
Hoorcollege 6: Enzymes
Enzymen versnellen niet alleen reacties, maar limiteren ook welke moleculen naar producten kunnen
worden geconverteerd.
−E A
Arrhenius vergelijking: RT , waarbij A de botsingsfrequentie is en de oriëntatie. Een
k =A e
katalysator kan dus:
- De activeringsenergie verlagen meestal met 35-50 kJ/mol. Het verlagen van de energie
gebeurt door transitiestaat complementariteit:
o Ladingscomplementariteit: gunstige
lading interacties of waterstofbruggen
o Vormcomplementariteit: geometrische
deformatie van het substraat. Een deel
van de bindingsenergie van ES wordt
gebruikt om het substraat te
vervormen.
- De pre-exponentiële factor (A) verhogen kan
gedaan worden door het binden van twee
substraten in grote nabijheid en met goede oriëntatie. Nabijheidseffecten zijn entropisch.
- Het mechanisme veranderen zuur/base katalyse van peptide hydrolyse. Bij een zuur wordt
nucleofiele additie toegepast op de C=O binding en bij een base op het watermolecuul. Het is
niet mogelijk om in een organisch lab beide methodes tegelijk te combineren. Enzymen
kunnen dit echter wel.
Bepaalde reacties vinden het beste plaats
bij bepaalde pH, daar zorgen enzymen ook
voor. Enzymen stellen aminozuur
reactiviteit af, van bijvoorbeeld; Asp, Glu,
His, Cys en Lys. Hoe modificeert een enzym
de pKa van Asp en Glu? Bij een positieve
lading bij Asp gaat de pKa omlaag (Asp wil
liever negatief zijn). Andersom geldt dit
voor een negatieve lading. Daarnaast kan
ook de polariteit aangepast worden. Bij
een polaire omgeving is de pKa normaal,
maar in een apolaire omgeving gaat de
pKa omhoog.
Bij ribonuclease-A accepteert His 12
een proton van de OH-groep van één
nucleotide, waarna het O-atoom de
fosfaatgroep aanvalt en een proton van
His 119 naar de verlatende nucleotide
gaat. Asp 121 stabiliseert de geprotoneerde staat van His 119.
1
,Nabijheidseffecten zijn vaak entropisch, zoals afstotende elektrostatische krachten wanneer twee
substraten bij elkaar moeten worden gebracht in een enzym.
Serine proteases breken amide bindingen en knippen dus eiwitten. Ze werken door de
activeringsenergie te verlagen en door lokaal een hoge concentratie nucleofielen te maken.
Daarnaast selecteren ze specifieke peptide sequenties. Trypsine is hier een voorbeeld van:
- Verandert
reactiemechanisme
- Gebruikt
ladingscomplementariteit
- Regelt aminozuur
reactiviteit
Chymotrypsine heeft een
hydrofobe pocket en knipt juist na
grote hydrofobe residuen.
De katalytische triade in de
actieve site van trypsine; het
maken van een sterk nucleofiel.
Het bestaat uit een serine, die
met de hydroxyl groep een H-
brug vormt met histidine, die
weer een H-brug vormt met
asparaginezuur:
- Negatief geladen Asp102
maakt His57 een sterkere base (pKa neemt toe)
- His57 trekt aan het H-atoom van de Ser195-OH
- Het O-atoom wordt negatief – alkoxide ion is een sterke nucleofiel
Het oxyanion hol stabiliseert de negatieve lading op de tetrahedrale transitiestaat. Een
katalytische triade is een goede oplossing voor het breken van peptidebindingen.
Eerst gaat de zeer nucleofiele zuurstof van serine een binding aan met de carbonyl groep van de
peptide. Hierdoor verandert de configuratie en blijft een formele negatieve lading op één van de O-
atomen achter (oxyanion). Dit wordt gestabiliseerd door de drie N-atomen van de backbone
(oxyanion hol). Het proton dat eerst aan de serine hydroxyl groep zat breekt de carbonyl-amide
stikstofbinding, waardoor het C-terminale segment vrijkomt en het N-terminale segment covalent
gebonden blijft aan het enzym en een ‘acyl-enzyme’ intermediair vormt. In de tweede stap wordt een
watermolecuul nucleofiel gemaakt door een H-brug aan te gaan met histidine. Het watermolecuul
gaat weer interacties aan met de carbonyl-groep, waardoor een tetrahedrale transitiestaat ontstaat.
Dit resulteert in de eliminatie van de serine zijketen.
Chorismaat dismutase zorgt voor rotatie van het fragment van chorismaat dat overgeplaatst moet
worden en positioneert de kritieke π-orbitalen van de dubbele bindingen in nabijheid. In de actieve
site heeft het positief geladen zijketens die interacties aangaan met de carboxylaten van het
substraat. Aminozuren die nooit een rol zullen spelen bij katalysereacties zijn hydrofobe aminozuren
(heeft altijd te maken met verplaatsing van elektronen).
2
, Transitiestaat analogen zijn goede competitieve inhibitoren. In tegenstelling tot het substraat hoeft
het transitiestaat analoog niet vervormd te worden bij binding en bindt daarom sterker (geen
verbruik van bindingsenergie).
Specificiteit: het binden van lysine of arginine in een diepe pocket bepaalt trypsine specificiteit.
De snelheid van formatie van product wordt de snelheid van de reactie genoemd, v. De snelheid aan
het begin van de reactie, waarbij nog maar weinig product is opgebouwd, is de beginsnelheid, v0.
Michaelis-Menten kinetiek:
- Vmax – v0 bij hoge substraatconcentratie
- KM – substraatconcentratie bij 50% van V max
E+S <-> ES E+P, waarbij k2 de snelheidsbepalende stap is, door de benadering dat de teruggaande
reactie van E+P te verwaarlozen is ([P] moet dan klein zijn). Steady state aanname: [ES] blijft
constant tijdens het meten van v0. v 0 =k 2 [ ES] . Aanname: [ S ] =[S] 0−[ ES]≈ [S] 0 , dus [S] is
constant tijdens het meten van v0 en [S] >>> [ES]. V max =k 2 [ E]0 . Dit leidt tot:
V max
v0 = k −1 +k 2
K en KM ≡
(1+ M ) k1
[ S]
1 1
f= =
K K . De formule met de KM geldt alleen in een steady-state situatie, terwijl de
1+ M 1+ D
[S] [S]
formule met KD alleen geldt in een evenwichtssituatie en is onafhankelijk van product formatie (
k −1
KD= ). Wanneer k2<<k-1 zal de waarde van KM de waarde van KD benaderen.
k1
Het turnover nummer of de katalytische snelheidsconstante: k cat is het maximale aantal
reacties/sec en vindt dus plaats bij hoge substraatconcentraties. Voor enzymen die voldoen aan de
MM-kinetiek is kcat gelijk aan k2. kcat is een enzymeigenschap, terwijl Vmax afhankelijk is van de
experimentele condities.
k cat
De katalytische efficiëntie: . Een hoge waarde indiceert hoge turnover nummers bij een lage
KM
substraatconcentratie. Het enzym superoxide dismutase wordt gezien als het ‘perfecte enzym’, omdat
het sneller zuurstofradicalen neutraliseert dan de diffusiesnelheid. Voor enzymen met een
regulerende rol is de katalytische efficiëntie niet relevant. Enzymen hebben vaak meerdere
substraten, waarvoor ze ook verschillenden katalytische efficiënties hebben. Wanneer
substraatconcentratie laag is, dan is de katalytische efficiëntie gelijk aan de snelheidsconstante en
wordt het ook wel de specificiteitsconstante genoemd.
Diffusie-gecontroleerde reacties worden alleen tegengehouden voor hoe snel het substraat botst met
het enzym. Enzymen kunnen sneller werken dan de diffusie-gecontroleerde limiet, doordat geladen
groepen rond de actieve site het substraat de goede kant op leiden (electrostatic steering).
In het echt is het dissociëren van product van het enzym nog een stap apart. Het enige verschil met
gewone MM-kinetiek is, dat wanneer product vrijlating langzaam is (en k 3 niet verwaarloosd kan
worden), handen de waardes van V max en K’M af van de snelheidsconstantes op een andere manier.
3
Chemie Deel 2
Hoorcollege 6: Enzymes
Enzymen versnellen niet alleen reacties, maar limiteren ook welke moleculen naar producten kunnen
worden geconverteerd.
−E A
Arrhenius vergelijking: RT , waarbij A de botsingsfrequentie is en de oriëntatie. Een
k =A e
katalysator kan dus:
- De activeringsenergie verlagen meestal met 35-50 kJ/mol. Het verlagen van de energie
gebeurt door transitiestaat complementariteit:
o Ladingscomplementariteit: gunstige
lading interacties of waterstofbruggen
o Vormcomplementariteit: geometrische
deformatie van het substraat. Een deel
van de bindingsenergie van ES wordt
gebruikt om het substraat te
vervormen.
- De pre-exponentiële factor (A) verhogen kan
gedaan worden door het binden van twee
substraten in grote nabijheid en met goede oriëntatie. Nabijheidseffecten zijn entropisch.
- Het mechanisme veranderen zuur/base katalyse van peptide hydrolyse. Bij een zuur wordt
nucleofiele additie toegepast op de C=O binding en bij een base op het watermolecuul. Het is
niet mogelijk om in een organisch lab beide methodes tegelijk te combineren. Enzymen
kunnen dit echter wel.
Bepaalde reacties vinden het beste plaats
bij bepaalde pH, daar zorgen enzymen ook
voor. Enzymen stellen aminozuur
reactiviteit af, van bijvoorbeeld; Asp, Glu,
His, Cys en Lys. Hoe modificeert een enzym
de pKa van Asp en Glu? Bij een positieve
lading bij Asp gaat de pKa omlaag (Asp wil
liever negatief zijn). Andersom geldt dit
voor een negatieve lading. Daarnaast kan
ook de polariteit aangepast worden. Bij
een polaire omgeving is de pKa normaal,
maar in een apolaire omgeving gaat de
pKa omhoog.
Bij ribonuclease-A accepteert His 12
een proton van de OH-groep van één
nucleotide, waarna het O-atoom de
fosfaatgroep aanvalt en een proton van
His 119 naar de verlatende nucleotide
gaat. Asp 121 stabiliseert de geprotoneerde staat van His 119.
1
,Nabijheidseffecten zijn vaak entropisch, zoals afstotende elektrostatische krachten wanneer twee
substraten bij elkaar moeten worden gebracht in een enzym.
Serine proteases breken amide bindingen en knippen dus eiwitten. Ze werken door de
activeringsenergie te verlagen en door lokaal een hoge concentratie nucleofielen te maken.
Daarnaast selecteren ze specifieke peptide sequenties. Trypsine is hier een voorbeeld van:
- Verandert
reactiemechanisme
- Gebruikt
ladingscomplementariteit
- Regelt aminozuur
reactiviteit
Chymotrypsine heeft een
hydrofobe pocket en knipt juist na
grote hydrofobe residuen.
De katalytische triade in de
actieve site van trypsine; het
maken van een sterk nucleofiel.
Het bestaat uit een serine, die
met de hydroxyl groep een H-
brug vormt met histidine, die
weer een H-brug vormt met
asparaginezuur:
- Negatief geladen Asp102
maakt His57 een sterkere base (pKa neemt toe)
- His57 trekt aan het H-atoom van de Ser195-OH
- Het O-atoom wordt negatief – alkoxide ion is een sterke nucleofiel
Het oxyanion hol stabiliseert de negatieve lading op de tetrahedrale transitiestaat. Een
katalytische triade is een goede oplossing voor het breken van peptidebindingen.
Eerst gaat de zeer nucleofiele zuurstof van serine een binding aan met de carbonyl groep van de
peptide. Hierdoor verandert de configuratie en blijft een formele negatieve lading op één van de O-
atomen achter (oxyanion). Dit wordt gestabiliseerd door de drie N-atomen van de backbone
(oxyanion hol). Het proton dat eerst aan de serine hydroxyl groep zat breekt de carbonyl-amide
stikstofbinding, waardoor het C-terminale segment vrijkomt en het N-terminale segment covalent
gebonden blijft aan het enzym en een ‘acyl-enzyme’ intermediair vormt. In de tweede stap wordt een
watermolecuul nucleofiel gemaakt door een H-brug aan te gaan met histidine. Het watermolecuul
gaat weer interacties aan met de carbonyl-groep, waardoor een tetrahedrale transitiestaat ontstaat.
Dit resulteert in de eliminatie van de serine zijketen.
Chorismaat dismutase zorgt voor rotatie van het fragment van chorismaat dat overgeplaatst moet
worden en positioneert de kritieke π-orbitalen van de dubbele bindingen in nabijheid. In de actieve
site heeft het positief geladen zijketens die interacties aangaan met de carboxylaten van het
substraat. Aminozuren die nooit een rol zullen spelen bij katalysereacties zijn hydrofobe aminozuren
(heeft altijd te maken met verplaatsing van elektronen).
2
, Transitiestaat analogen zijn goede competitieve inhibitoren. In tegenstelling tot het substraat hoeft
het transitiestaat analoog niet vervormd te worden bij binding en bindt daarom sterker (geen
verbruik van bindingsenergie).
Specificiteit: het binden van lysine of arginine in een diepe pocket bepaalt trypsine specificiteit.
De snelheid van formatie van product wordt de snelheid van de reactie genoemd, v. De snelheid aan
het begin van de reactie, waarbij nog maar weinig product is opgebouwd, is de beginsnelheid, v0.
Michaelis-Menten kinetiek:
- Vmax – v0 bij hoge substraatconcentratie
- KM – substraatconcentratie bij 50% van V max
E+S <-> ES E+P, waarbij k2 de snelheidsbepalende stap is, door de benadering dat de teruggaande
reactie van E+P te verwaarlozen is ([P] moet dan klein zijn). Steady state aanname: [ES] blijft
constant tijdens het meten van v0. v 0 =k 2 [ ES] . Aanname: [ S ] =[S] 0−[ ES]≈ [S] 0 , dus [S] is
constant tijdens het meten van v0 en [S] >>> [ES]. V max =k 2 [ E]0 . Dit leidt tot:
V max
v0 = k −1 +k 2
K en KM ≡
(1+ M ) k1
[ S]
1 1
f= =
K K . De formule met de KM geldt alleen in een steady-state situatie, terwijl de
1+ M 1+ D
[S] [S]
formule met KD alleen geldt in een evenwichtssituatie en is onafhankelijk van product formatie (
k −1
KD= ). Wanneer k2<<k-1 zal de waarde van KM de waarde van KD benaderen.
k1
Het turnover nummer of de katalytische snelheidsconstante: k cat is het maximale aantal
reacties/sec en vindt dus plaats bij hoge substraatconcentraties. Voor enzymen die voldoen aan de
MM-kinetiek is kcat gelijk aan k2. kcat is een enzymeigenschap, terwijl Vmax afhankelijk is van de
experimentele condities.
k cat
De katalytische efficiëntie: . Een hoge waarde indiceert hoge turnover nummers bij een lage
KM
substraatconcentratie. Het enzym superoxide dismutase wordt gezien als het ‘perfecte enzym’, omdat
het sneller zuurstofradicalen neutraliseert dan de diffusiesnelheid. Voor enzymen met een
regulerende rol is de katalytische efficiëntie niet relevant. Enzymen hebben vaak meerdere
substraten, waarvoor ze ook verschillenden katalytische efficiënties hebben. Wanneer
substraatconcentratie laag is, dan is de katalytische efficiëntie gelijk aan de snelheidsconstante en
wordt het ook wel de specificiteitsconstante genoemd.
Diffusie-gecontroleerde reacties worden alleen tegengehouden voor hoe snel het substraat botst met
het enzym. Enzymen kunnen sneller werken dan de diffusie-gecontroleerde limiet, doordat geladen
groepen rond de actieve site het substraat de goede kant op leiden (electrostatic steering).
In het echt is het dissociëren van product van het enzym nog een stap apart. Het enige verschil met
gewone MM-kinetiek is, dat wanneer product vrijlating langzaam is (en k 3 niet verwaarloosd kan
worden), handen de waardes van V max en K’M af van de snelheidsconstantes op een andere manier.
3
