HCO3 recombinant DNA technologie
Typisch klonering experiment, vaak wordt een bepaald gen in een
plasmide geïnserteerd dat een bepaalde resistentie bevat. Vervolgens
wordt dit plasmide ingebracht bij bacteriën en zullen zij gaan
vermenigvuldigen. Je kan dan het plasmide DNA weer eruit halen of je
laat de bacteriën eiwitten produceren die gecodeerd worden door het
geïnserteerde gen.
Faag lambda, onderzoek naar deze faag heeft geleid tot het vinden
van restrictie-enzymen. De CRISPR-Cas techniek is ook uit infectie
middels fagen gehaald. Als de faag zijn DNA injecteert, zijn er twee
mogelijkheden: lysogene (integratie) of lytische cyclus (multiplicatie).
Bescherming tegen fagen, in de afbeelding zijn twee E. coli stammen
te zien: B en K. Infectie middels fagen, levert een paar plaques op
waar de lytische cyclus dus is ondergaan. Als fagen uit bacteriestam B op
bacteriestam K gezet worden, is de faag veel minder effectief dan
wanneer die opnieuw op bacteriestam B gezet wordt. De fagen passen
zich dus aan aan de bacterie door het beschermingsmechanisme van de
bacterie te omzeilen.
EcoRV restrictie modificatie systeem, bevat zowel een restrictie (EcoRV
nuclease) als een modificatie (EcoRV methylase) enzym. Middels dit
systeem beschermt een bacterie zich tegen DNA van buitenaf.
Geïnjecteerd faag DNA is gevoelig voor EcoRV nuclease en zal in stukjes
geknipt worden. De faag overleeft dit niet en de bacterie is dus resistent
tegen de betreffende faag. Ook het DNA van de bacterie zelf bevat echter
stukken DNA die door de nuclease herkend worden, maar dit
wordt gemodificeerd door EcoRV methylase, waardoor de
bacterie beschermd is tegen zijn eigen nuclease. De meeste
fagen worden dus gedood door dit systeem, maar soms glipt er
een doorheen en deze zijn dan heel succesvol als ze nog een
keer op de betreffende bacteriestam geplaatst worden, omdat
het faag DNA dan ook gemodificeerd is door EcoRV methylase.
Dit gebeurt dus als het faag DNA eerder wordt gemethyleerd dan
dat het geknipt wordt.
De restrictie en modificatie systemen komen in heel veel
bacteriën voor en herkennen bij elke bacterie weer net een
andere sequentie.
Restrictie/modificatie enzymen, zijn sequentie specifiek en bewerken dubbelstrengs DNA. Het
restrictie-enzym is een endonuclease (knipt middenin) en geeft een 3’ OH en 5’ P uiteinde. Verder
zijn de modificatie enzymen base-flipping enzymen die A of C basen methyleren. Deze methylatie
wordt ook overgenomen bij replicatie.
Restrictie endonuclease, deze bacteriële enzymen herkennen specifieke nucleotiden sequenties in
het DNA (normaal 4-8 bp lang) en beschermen bacteriën tegen virale infecties. Er zijn verschillende
soorten restrictie-enzymen:
- Type I, klieft op een locatie die anders is dan de herkenningssequentie.
- Type II, herkent en klieft DNA op een palindroom sequentie.
o Zo knipt BamH I bij de sequentie die rechts is te zien.
Naam restrictie-enzym, is afkomstig van de bacterie waar die uitkomt.
Restrictie-frequentie, als je een enzym hebt met de herkenningsfrequentie CGCG is het afhankelijk
van de hoeveelheid CG’s in het genoom. De GC inhoud van het genoom en de herkenningssite zijn
, dus van belang. Als je uitgaat van een genoom met dezelfde hoeveelheden A, T, C en G’s kan
je uitrekenen hoe vaak de herkenning site voor kan komen:
- Bijvoorbeeld, 5’ GAATTC 3’ (6 basen) heeft een frequentie van 0,25(𝐺) ∗ 0,25(𝐴) ∗
1
0,25(𝐴) ∗ 0,25(𝑇) ∗ 0,25(𝑇) ∗ 0,25(𝐶) = 0,256 → 0,256 = 4.096. Je hebt dus
gemiddeld 1 knipje per 4096 bp.
Knip, restrictie-enzymen knippen allemaal bij verschillende sequenties en ook op
verschillende manieren. Zo kunnen er na de knip twee sticky ends ontstaan of twee blunt
ends (HpaI). Verder zie je dat EcoRI en HindIII een 5’ overhang creeëren, maar dat Pstl juist
een 3’ overhang creëert.
Dimeer, restrictie-enzymen werken als een dimeer, want aan beide kanten van de streng
moet geknipt worden.
Ligatie, twee complementaire sticky ends kunnen aan elkaar
geplakt worden m.b.v. ligase. Ligase wordt geactiveerd
middels ATP, waardoor een enzym-adenylaat complex
ontstaat. Dit complex bindt aan de uitstekende fosfaatgroep
en zorgt dat deze reageert met de uitstekende OH groep van
de naastgelegen nucleotide, waardoor een fosfodiëster
binding tot stand komt. De fosfaatgroep aan de 5’ kant en OH groep
aan de 3’ accent kant zijn hiervoor dus wel essentieel.
Fosfatase, als je een stuk DNA in een
plasmide wil zetten, kan je de betreffende
plasmide met twee restrictie-enzymen
knippen, zodat er geen complementaire
sticky ends ontstaan. Je kan de plasmide
echter ook met maar één enzym knippen.
Om te voorkomen dat de sticky ends dan weer terug ligeren, kan je de
fosfaatgroepen verwijderen m.b.v. fosfatase. Zonder deze fosfaatgroepen
kan er namelijk geen ligatie reactie plaatsvinden. Vervolgens maak je het
fragment dat je wil kloneren met hetzelfde restrictie-enzym. Dit fragment
behandel je echter niet met fosfatase. Op deze manier kan het fragment al
op twee plekken covalent vastgemaakt worden, aangezien op die punten
zowel de 5’ fosfaatgroep als de 3’ OH groep aanwezig zijn. Als een bacterie
vervolgens het plasmide opneemt, zal die ervoor zorgen dat de enkele
breuken die nog over zijn hersteld worden.
Kloneringsplasmide, voor klonering middels
plasmiden maken we gebruik van kleine
plasmiden die vaak gebaseerd zijn op pUC18. Deze
bevat een ORI zodat die gerepliceerd kan worden
door de bacterie en een antibioticum resistentie zodat je kan selecteren op
bacteriën die hem opgenomen hebben. Ook bevat het plasmide een
multiple cloning site wat wil zeggen dat daar meerdere unieke restrictie
sites aanwezig zijn, waardoor meerdere fragmenten geïnserteerd kunnen
worden. Zo’n insert kan 100-10.000 bp lang zijn. Verder bevat het plasmide
dat links in de afbeelding te zien is ook een lacZ marker wat het mogelijk
maakt om de selecteren op cellen die een plasmide met de insertie bevatten.
pUC plasmide en lacZ screening, lacZ codeert voor een heel groot eiwit: β-galactosidase. Als je dit
eiwit incubeert met het substraat, XGal, krijg je een blauwe kleur. Het lacZ gen is echter heel erg
groot en omvat al een half plasmide, vandaar dat in de pUC plasmide alleen het kleine stukje eiwit
dat actief reageert met XGal aanwezig is: α-peptide. De multiple cloning site bevindt zich in het
coderende stuk van α-peptide en als de insertie dus geslaagd is, krijg je geen actief α-peptide.
Typisch klonering experiment, vaak wordt een bepaald gen in een
plasmide geïnserteerd dat een bepaalde resistentie bevat. Vervolgens
wordt dit plasmide ingebracht bij bacteriën en zullen zij gaan
vermenigvuldigen. Je kan dan het plasmide DNA weer eruit halen of je
laat de bacteriën eiwitten produceren die gecodeerd worden door het
geïnserteerde gen.
Faag lambda, onderzoek naar deze faag heeft geleid tot het vinden
van restrictie-enzymen. De CRISPR-Cas techniek is ook uit infectie
middels fagen gehaald. Als de faag zijn DNA injecteert, zijn er twee
mogelijkheden: lysogene (integratie) of lytische cyclus (multiplicatie).
Bescherming tegen fagen, in de afbeelding zijn twee E. coli stammen
te zien: B en K. Infectie middels fagen, levert een paar plaques op
waar de lytische cyclus dus is ondergaan. Als fagen uit bacteriestam B op
bacteriestam K gezet worden, is de faag veel minder effectief dan
wanneer die opnieuw op bacteriestam B gezet wordt. De fagen passen
zich dus aan aan de bacterie door het beschermingsmechanisme van de
bacterie te omzeilen.
EcoRV restrictie modificatie systeem, bevat zowel een restrictie (EcoRV
nuclease) als een modificatie (EcoRV methylase) enzym. Middels dit
systeem beschermt een bacterie zich tegen DNA van buitenaf.
Geïnjecteerd faag DNA is gevoelig voor EcoRV nuclease en zal in stukjes
geknipt worden. De faag overleeft dit niet en de bacterie is dus resistent
tegen de betreffende faag. Ook het DNA van de bacterie zelf bevat echter
stukken DNA die door de nuclease herkend worden, maar dit
wordt gemodificeerd door EcoRV methylase, waardoor de
bacterie beschermd is tegen zijn eigen nuclease. De meeste
fagen worden dus gedood door dit systeem, maar soms glipt er
een doorheen en deze zijn dan heel succesvol als ze nog een
keer op de betreffende bacteriestam geplaatst worden, omdat
het faag DNA dan ook gemodificeerd is door EcoRV methylase.
Dit gebeurt dus als het faag DNA eerder wordt gemethyleerd dan
dat het geknipt wordt.
De restrictie en modificatie systemen komen in heel veel
bacteriën voor en herkennen bij elke bacterie weer net een
andere sequentie.
Restrictie/modificatie enzymen, zijn sequentie specifiek en bewerken dubbelstrengs DNA. Het
restrictie-enzym is een endonuclease (knipt middenin) en geeft een 3’ OH en 5’ P uiteinde. Verder
zijn de modificatie enzymen base-flipping enzymen die A of C basen methyleren. Deze methylatie
wordt ook overgenomen bij replicatie.
Restrictie endonuclease, deze bacteriële enzymen herkennen specifieke nucleotiden sequenties in
het DNA (normaal 4-8 bp lang) en beschermen bacteriën tegen virale infecties. Er zijn verschillende
soorten restrictie-enzymen:
- Type I, klieft op een locatie die anders is dan de herkenningssequentie.
- Type II, herkent en klieft DNA op een palindroom sequentie.
o Zo knipt BamH I bij de sequentie die rechts is te zien.
Naam restrictie-enzym, is afkomstig van de bacterie waar die uitkomt.
Restrictie-frequentie, als je een enzym hebt met de herkenningsfrequentie CGCG is het afhankelijk
van de hoeveelheid CG’s in het genoom. De GC inhoud van het genoom en de herkenningssite zijn
, dus van belang. Als je uitgaat van een genoom met dezelfde hoeveelheden A, T, C en G’s kan
je uitrekenen hoe vaak de herkenning site voor kan komen:
- Bijvoorbeeld, 5’ GAATTC 3’ (6 basen) heeft een frequentie van 0,25(𝐺) ∗ 0,25(𝐴) ∗
1
0,25(𝐴) ∗ 0,25(𝑇) ∗ 0,25(𝑇) ∗ 0,25(𝐶) = 0,256 → 0,256 = 4.096. Je hebt dus
gemiddeld 1 knipje per 4096 bp.
Knip, restrictie-enzymen knippen allemaal bij verschillende sequenties en ook op
verschillende manieren. Zo kunnen er na de knip twee sticky ends ontstaan of twee blunt
ends (HpaI). Verder zie je dat EcoRI en HindIII een 5’ overhang creeëren, maar dat Pstl juist
een 3’ overhang creëert.
Dimeer, restrictie-enzymen werken als een dimeer, want aan beide kanten van de streng
moet geknipt worden.
Ligatie, twee complementaire sticky ends kunnen aan elkaar
geplakt worden m.b.v. ligase. Ligase wordt geactiveerd
middels ATP, waardoor een enzym-adenylaat complex
ontstaat. Dit complex bindt aan de uitstekende fosfaatgroep
en zorgt dat deze reageert met de uitstekende OH groep van
de naastgelegen nucleotide, waardoor een fosfodiëster
binding tot stand komt. De fosfaatgroep aan de 5’ kant en OH groep
aan de 3’ accent kant zijn hiervoor dus wel essentieel.
Fosfatase, als je een stuk DNA in een
plasmide wil zetten, kan je de betreffende
plasmide met twee restrictie-enzymen
knippen, zodat er geen complementaire
sticky ends ontstaan. Je kan de plasmide
echter ook met maar één enzym knippen.
Om te voorkomen dat de sticky ends dan weer terug ligeren, kan je de
fosfaatgroepen verwijderen m.b.v. fosfatase. Zonder deze fosfaatgroepen
kan er namelijk geen ligatie reactie plaatsvinden. Vervolgens maak je het
fragment dat je wil kloneren met hetzelfde restrictie-enzym. Dit fragment
behandel je echter niet met fosfatase. Op deze manier kan het fragment al
op twee plekken covalent vastgemaakt worden, aangezien op die punten
zowel de 5’ fosfaatgroep als de 3’ OH groep aanwezig zijn. Als een bacterie
vervolgens het plasmide opneemt, zal die ervoor zorgen dat de enkele
breuken die nog over zijn hersteld worden.
Kloneringsplasmide, voor klonering middels
plasmiden maken we gebruik van kleine
plasmiden die vaak gebaseerd zijn op pUC18. Deze
bevat een ORI zodat die gerepliceerd kan worden
door de bacterie en een antibioticum resistentie zodat je kan selecteren op
bacteriën die hem opgenomen hebben. Ook bevat het plasmide een
multiple cloning site wat wil zeggen dat daar meerdere unieke restrictie
sites aanwezig zijn, waardoor meerdere fragmenten geïnserteerd kunnen
worden. Zo’n insert kan 100-10.000 bp lang zijn. Verder bevat het plasmide
dat links in de afbeelding te zien is ook een lacZ marker wat het mogelijk
maakt om de selecteren op cellen die een plasmide met de insertie bevatten.
pUC plasmide en lacZ screening, lacZ codeert voor een heel groot eiwit: β-galactosidase. Als je dit
eiwit incubeert met het substraat, XGal, krijg je een blauwe kleur. Het lacZ gen is echter heel erg
groot en omvat al een half plasmide, vandaar dat in de pUC plasmide alleen het kleine stukje eiwit
dat actief reageert met XGal aanwezig is: α-peptide. De multiple cloning site bevindt zich in het
coderende stuk van α-peptide en als de insertie dus geslaagd is, krijg je geen actief α-peptide.
