Biotechnologie
Life Sciences – Hogeschool Utrecht
Semester 6
Les 1 Inleiding biotechnologie
Biotechnologie = toegepaste moleculaire biologie → nadruk op productie (commercieel)
Bijvoorbeeld maken & optimaliseren van:
- gewassen
- medicijnen
- vaccines
- diagnostiek
- levensmiddelen
Hierbij wordt vaak een levend organisme toegepast en de biologische kennis voor het produceren
Overzicht vectoren
,Er is een DNA transfer nodig om de expressievector met gekloneerd g.o.i. samen te brengen met de
geschikte gastheercel
Overzicht DNA transfer methoden
Rode biotechnologie: therapeutisch recombinante eiwitten produceren
Categorieën recombinante eiwitten:
Groene biotechnologie: landbouwgewassen
,Witte biotechnologie: industrieel en huishoudelijk (o.a. biokatalyse)
Blauwe/bruine/ grijze biotechnologie:
Veelgebruikte expressiesystemen
Keuze expressiesysteem is altijd een compromis
, Les 2, 3 & 6 extra belangrijk
voor tentamen!!
Les 2 Isolatie en mutatie van een gene of interest
Isolatie van een gene of interest
Om een gen te isoleren om vervolgens te kunnen gebruiken, zijn er verschillende methoden:
- D.m.v. een DNA bank
o Genomisch DNA
o Complementair/copy DNA (cDNA) → toegepast bij praktijklessen
o Screening d.m.v. kolonie hybridisatie
o Screening d.m.v. expressie
- D.m.v. PCR
- D.m.v. DNA synthese
`
Omdat een lang stuk DNA niet goed
bewerkbaar is, wordt het gefragmenteerd
(door restrictie enzymen)waarbij het
gewenste deel over blijft. Dit wordt in een
plasmide geplaatst, zodat het stabiel en
bewerkbaar is. Een plasmide kan daarbij
ook in een bacterie geplaatst worden wat
replicatie mogelijk maakt.
cDNA bank is een beter alternatief voor de genomische bank, want; Hierbij wordt RNA geïsoleerd in
plaats van DNA, wat geeft dat je
onnodige informatie niet meer
meeneemt (intronen)
Door hier cDNA van te maken kan
er weer dubbelstrengs van gemaakt
worden. Dat kan niet met RNA.
Voordeel van dubbelstrengs (en dus
van cDNA) is dat het stabieler en
dus bewerkbaar is
, Door reverse transcriptase wordt van RNA
een cDNA streng gemaakt. Dit gebruikt weer
de T nucleotide in plaats van U.
Het heeft wel een primer nodig. Vaak
oligo(dT) gebruikt, omdat dit lange T staart
heeft wat complementair is aan de AAA 3’
kant van RNA.
DNA polymerase I maakt van het
enkelstrengs cDNA een dubbele streng
Door linkers of adapters (korte stukjes
gesynthetiseerde DNA) die specifiek zijn kan je
restrictie sites toevoegen aan je stukje cDNA.
Daarmee kan het cDNA dan in een plasmide
geligeerd worden.
Problemen bij het maken van cDNA bank
- Moeilijk om het complete gen te pakken te krijgen (lage processivity Reverse Transcriptase)
RT komt niet altijd tot het einde van RNA streng want heeft lage uithoudingsvermogen. Dus maar
korte stukjes cDNA van een lange RNA streng
- RNAse activiteit, mRNA instabiliteit
- Hairpins in mRNA
Reverse Transcriptase en DNA Pol I kan hier dan niet verder
Omdat het lastig kan zijn om cDNA te maken, kan je het ook kopen.
Te bestellen op orgaanweefseltype, grootte, vector soort, insert size etc.
, Tijdens praktijklessen wordt identificatie gedaan
d.m.v. PCR. Dit is een andere methode
Kolonies met verschillende plasmiden uitgroeien op
platen. Door platen te behandelen dat het DNA vrij
komt en enkelstrengs wordt, kunnen probes
toegevoegd worden. Dit zijn enkelstrengs DNA
stukjes met een label die specifiek en complementair
zijn voor het stukje gewenst DNA uit de plasmide.
Label aan de probes leidt terug naar de kolonies die
het gewenste plasmide bevatten wat complementair
aan probe was. Dan die kolonies verder klonen.
Vaak wordt een eiwit van interesse geïsoleerd om verder te
onderzoeken in plaats van door gelijk DNA te isoleren
Dan eerst de aminozuurvolgorde van het eiwit bepalen.
Vervolgens de codons voor die aminozuren terugleiden naar
de RNA sequentie. Doordat 1 aminozuur meerdere codons
heeft, zijn er heel veel mogelijke DNA sequenties.
Om dan een probe te ontwikkelen wordt dus heel moeilijk
door de verschillende mogelijkheden.
Opties: meerdere soorten probes maken en toevoegen aan de
mix of de omstandigheden zo maken dat met een mindere
goed passende probe toch nog een binding gemaakt wordt
In plaats van probe kan ook een antilichaam gebruikt
worden, omdat dit ook kan binden op een specifieke
eiwitplaats en kunnen ook gelabeld worden.
Dan moet je wel weten dat het eiwit tot expressie komt
anders kan een antilichaam niet binden aan het eiwit
, Genisolatie m.b.v. PCR
Door primer te nemen die voor verschillende restrictie sites
ligt, kan het later dit stukje DNA gemakkelijk in een
plasmide ligeren.
T-vector: Taq polymerase eindigt altijd met een 3’A staart
Dit kan als alternatief gebruikt worden als er geen restrictie
sites zijn. Als het volgende stuk dan met een T staart begint
overhangt het met de A staart
Nadelen genisolatie d.m.v. PCR:
- Geamplificeerde fragmenten meestal te kort om compleet gen te bevatten
- Exonen afzonderlijk PCR > complexe constructen
- PCR procedure induceert vaak mutaties in de sequentie, er is namelijk geen proofreading
- Voor primer ontwerp moet er sequentie informatie beschikbaar zijn
Er zijn apparaten die DNA synthetiseren. Door de gewenste code op te geven wordt dan die
enkelstrengs sequentie gemaakt. In 4 flesjes zitten de 4 nucleotiden die nodig zijn.
Kan tot 1000 nt en het is ook nog niet foutloos. Wel handig voor ontwerp van primers (25 nt)
Mutagenese en protein engineering
Er is behoefte aan stabiele eiwitten omdat
industriële processen onder vaak ongunstige
omstandigheden verlopen.
Extra zwavelbruggen toevoegen zou een eiwit
bijvoorbeeld stabieler maken. Daarom behoefte
aan eiwit aanpassing → protein engineering
,Voor rode biotech (medische kant) kan het gunstig zijn om een eiwit aan te passen zodat het
specifieker bindt (minder bijwerkingen) en om een langere circulatie tijd te bereiken (minder
injecties nodig)
Als je maar een bepaald stukje van een eiwit wilt
onderzoeken kan je een stuk gen verwijderen
(deletie) zodat je specifiek dat stukje kunt
onderzoeken waar je interesse in hebt
Zoals GFP uit kwallen kan je ook
naar andere organismen zoeken
voor soortgelijke labels
Specifieke mutaties aanbrengen
geeft vaak meer bruikbare
resultaten dan random mutagenese
(dan moet je lang proberen en weer
opnieuw doorlopen)
, Base-pair substitutie
→ kan silent, missense of nonsense
of
Base-pair insertie of deletie
Door ervoor zorgen dat een deletie of
insertie bij een restrictie site precies 3
nucleotiden is, krijg je geen frameshift in
je coderende DNA
Bij het ligeren kan je op verschillende
manieren ‘plakken’ zonder daarbij teveel
mutaties aan te brengen
Later konden er ook enkelstrengs oligo
fragmenten gemaakt worden met
bewust een mutatie erin. Deze
mutatie wordt met PCR later dan
meegenomen waardoor elk fragment
deze mutatie bevat.
De ‘cirkel’ in de afbeelding stelt een
plasmide voor
, Ook hier wordt een bewuste mutatie
in een gen construct geplaatst
Ditzelfde kan met insertie en deletie
(plaatje hieronder)
onder)
Gene editing
Het is sinds enige jaren mogelijk om direct mutatie aan te brengen in genomen van levende cellen en
organismen
Bekendste voorbeeld: Crispr-Cas9
Fusie-eiwitten en in frame klonering
Door de genen van 2 eiwitten aan elkaar te
koppelen, krijg je een eiwit dat beide
eigenschappen bezit = fusie eiwit
Het leesframe van beide genen moet dan
intact blijven.
Ook moet het stopcodon na het eerste gen
eruit, anders wordt het tweede gen niet
afgeschreven
Dit is wat anders dan 2 bestaande eiwitten
aan elkaar ‘plakken’
Eiwit kan door een ‘tag’ eraan beter gevolgd
worden.
Door een tag kan het beter gezuiverd
worden
Als eiwitten niet goed oplossen kan
oplosbaarheid verbeterd worden.
…
Life Sciences – Hogeschool Utrecht
Semester 6
Les 1 Inleiding biotechnologie
Biotechnologie = toegepaste moleculaire biologie → nadruk op productie (commercieel)
Bijvoorbeeld maken & optimaliseren van:
- gewassen
- medicijnen
- vaccines
- diagnostiek
- levensmiddelen
Hierbij wordt vaak een levend organisme toegepast en de biologische kennis voor het produceren
Overzicht vectoren
,Er is een DNA transfer nodig om de expressievector met gekloneerd g.o.i. samen te brengen met de
geschikte gastheercel
Overzicht DNA transfer methoden
Rode biotechnologie: therapeutisch recombinante eiwitten produceren
Categorieën recombinante eiwitten:
Groene biotechnologie: landbouwgewassen
,Witte biotechnologie: industrieel en huishoudelijk (o.a. biokatalyse)
Blauwe/bruine/ grijze biotechnologie:
Veelgebruikte expressiesystemen
Keuze expressiesysteem is altijd een compromis
, Les 2, 3 & 6 extra belangrijk
voor tentamen!!
Les 2 Isolatie en mutatie van een gene of interest
Isolatie van een gene of interest
Om een gen te isoleren om vervolgens te kunnen gebruiken, zijn er verschillende methoden:
- D.m.v. een DNA bank
o Genomisch DNA
o Complementair/copy DNA (cDNA) → toegepast bij praktijklessen
o Screening d.m.v. kolonie hybridisatie
o Screening d.m.v. expressie
- D.m.v. PCR
- D.m.v. DNA synthese
`
Omdat een lang stuk DNA niet goed
bewerkbaar is, wordt het gefragmenteerd
(door restrictie enzymen)waarbij het
gewenste deel over blijft. Dit wordt in een
plasmide geplaatst, zodat het stabiel en
bewerkbaar is. Een plasmide kan daarbij
ook in een bacterie geplaatst worden wat
replicatie mogelijk maakt.
cDNA bank is een beter alternatief voor de genomische bank, want; Hierbij wordt RNA geïsoleerd in
plaats van DNA, wat geeft dat je
onnodige informatie niet meer
meeneemt (intronen)
Door hier cDNA van te maken kan
er weer dubbelstrengs van gemaakt
worden. Dat kan niet met RNA.
Voordeel van dubbelstrengs (en dus
van cDNA) is dat het stabieler en
dus bewerkbaar is
, Door reverse transcriptase wordt van RNA
een cDNA streng gemaakt. Dit gebruikt weer
de T nucleotide in plaats van U.
Het heeft wel een primer nodig. Vaak
oligo(dT) gebruikt, omdat dit lange T staart
heeft wat complementair is aan de AAA 3’
kant van RNA.
DNA polymerase I maakt van het
enkelstrengs cDNA een dubbele streng
Door linkers of adapters (korte stukjes
gesynthetiseerde DNA) die specifiek zijn kan je
restrictie sites toevoegen aan je stukje cDNA.
Daarmee kan het cDNA dan in een plasmide
geligeerd worden.
Problemen bij het maken van cDNA bank
- Moeilijk om het complete gen te pakken te krijgen (lage processivity Reverse Transcriptase)
RT komt niet altijd tot het einde van RNA streng want heeft lage uithoudingsvermogen. Dus maar
korte stukjes cDNA van een lange RNA streng
- RNAse activiteit, mRNA instabiliteit
- Hairpins in mRNA
Reverse Transcriptase en DNA Pol I kan hier dan niet verder
Omdat het lastig kan zijn om cDNA te maken, kan je het ook kopen.
Te bestellen op orgaanweefseltype, grootte, vector soort, insert size etc.
, Tijdens praktijklessen wordt identificatie gedaan
d.m.v. PCR. Dit is een andere methode
Kolonies met verschillende plasmiden uitgroeien op
platen. Door platen te behandelen dat het DNA vrij
komt en enkelstrengs wordt, kunnen probes
toegevoegd worden. Dit zijn enkelstrengs DNA
stukjes met een label die specifiek en complementair
zijn voor het stukje gewenst DNA uit de plasmide.
Label aan de probes leidt terug naar de kolonies die
het gewenste plasmide bevatten wat complementair
aan probe was. Dan die kolonies verder klonen.
Vaak wordt een eiwit van interesse geïsoleerd om verder te
onderzoeken in plaats van door gelijk DNA te isoleren
Dan eerst de aminozuurvolgorde van het eiwit bepalen.
Vervolgens de codons voor die aminozuren terugleiden naar
de RNA sequentie. Doordat 1 aminozuur meerdere codons
heeft, zijn er heel veel mogelijke DNA sequenties.
Om dan een probe te ontwikkelen wordt dus heel moeilijk
door de verschillende mogelijkheden.
Opties: meerdere soorten probes maken en toevoegen aan de
mix of de omstandigheden zo maken dat met een mindere
goed passende probe toch nog een binding gemaakt wordt
In plaats van probe kan ook een antilichaam gebruikt
worden, omdat dit ook kan binden op een specifieke
eiwitplaats en kunnen ook gelabeld worden.
Dan moet je wel weten dat het eiwit tot expressie komt
anders kan een antilichaam niet binden aan het eiwit
, Genisolatie m.b.v. PCR
Door primer te nemen die voor verschillende restrictie sites
ligt, kan het later dit stukje DNA gemakkelijk in een
plasmide ligeren.
T-vector: Taq polymerase eindigt altijd met een 3’A staart
Dit kan als alternatief gebruikt worden als er geen restrictie
sites zijn. Als het volgende stuk dan met een T staart begint
overhangt het met de A staart
Nadelen genisolatie d.m.v. PCR:
- Geamplificeerde fragmenten meestal te kort om compleet gen te bevatten
- Exonen afzonderlijk PCR > complexe constructen
- PCR procedure induceert vaak mutaties in de sequentie, er is namelijk geen proofreading
- Voor primer ontwerp moet er sequentie informatie beschikbaar zijn
Er zijn apparaten die DNA synthetiseren. Door de gewenste code op te geven wordt dan die
enkelstrengs sequentie gemaakt. In 4 flesjes zitten de 4 nucleotiden die nodig zijn.
Kan tot 1000 nt en het is ook nog niet foutloos. Wel handig voor ontwerp van primers (25 nt)
Mutagenese en protein engineering
Er is behoefte aan stabiele eiwitten omdat
industriële processen onder vaak ongunstige
omstandigheden verlopen.
Extra zwavelbruggen toevoegen zou een eiwit
bijvoorbeeld stabieler maken. Daarom behoefte
aan eiwit aanpassing → protein engineering
,Voor rode biotech (medische kant) kan het gunstig zijn om een eiwit aan te passen zodat het
specifieker bindt (minder bijwerkingen) en om een langere circulatie tijd te bereiken (minder
injecties nodig)
Als je maar een bepaald stukje van een eiwit wilt
onderzoeken kan je een stuk gen verwijderen
(deletie) zodat je specifiek dat stukje kunt
onderzoeken waar je interesse in hebt
Zoals GFP uit kwallen kan je ook
naar andere organismen zoeken
voor soortgelijke labels
Specifieke mutaties aanbrengen
geeft vaak meer bruikbare
resultaten dan random mutagenese
(dan moet je lang proberen en weer
opnieuw doorlopen)
, Base-pair substitutie
→ kan silent, missense of nonsense
of
Base-pair insertie of deletie
Door ervoor zorgen dat een deletie of
insertie bij een restrictie site precies 3
nucleotiden is, krijg je geen frameshift in
je coderende DNA
Bij het ligeren kan je op verschillende
manieren ‘plakken’ zonder daarbij teveel
mutaties aan te brengen
Later konden er ook enkelstrengs oligo
fragmenten gemaakt worden met
bewust een mutatie erin. Deze
mutatie wordt met PCR later dan
meegenomen waardoor elk fragment
deze mutatie bevat.
De ‘cirkel’ in de afbeelding stelt een
plasmide voor
, Ook hier wordt een bewuste mutatie
in een gen construct geplaatst
Ditzelfde kan met insertie en deletie
(plaatje hieronder)
onder)
Gene editing
Het is sinds enige jaren mogelijk om direct mutatie aan te brengen in genomen van levende cellen en
organismen
Bekendste voorbeeld: Crispr-Cas9
Fusie-eiwitten en in frame klonering
Door de genen van 2 eiwitten aan elkaar te
koppelen, krijg je een eiwit dat beide
eigenschappen bezit = fusie eiwit
Het leesframe van beide genen moet dan
intact blijven.
Ook moet het stopcodon na het eerste gen
eruit, anders wordt het tweede gen niet
afgeschreven
Dit is wat anders dan 2 bestaande eiwitten
aan elkaar ‘plakken’
Eiwit kan door een ‘tag’ eraan beter gevolgd
worden.
Door een tag kan het beter gezuiverd
worden
Als eiwitten niet goed oplossen kan
oplosbaarheid verbeterd worden.
…
