Deney No: 4
Deneyin Adı: Seri Dilüsyon ve Sayım Yöntemleri
Deneyin amacı: Yayma plak yöntemi ile hücre ekimi yapılması ve sayım yöntemlerinden biri
seçilerek hücrelerin sayılması amaçlanmaktadır.
Teorik Bilgi
Doğada, mikroorganizmalar genellikle karmaşık çoklu türler topluluğu olarak bulunur.
Organizmanın morfolojisini, patojenitesini ve moleküler genomik modelini bilmek için tek bir
türün karakterize edilmesi gerekir. Bir türü karakterize etmek için organizmaları saf biçimde
izole etmeliyiz. Saf kültür veya aksenik kültür, yalnızca bir tür organizma içeren bir kültürdür.
Saf kültürde tek bir organizmanın soyundan gelenlere tür denir. Bir suş tek bir koloni oluşturur.
Koloni, ailenin tüm karakterlerinin aynı kaldığı bir mikroorganizma kümesidir. Saf kültür
tekniklerinin ortaya çıkmasıyla birlikte birçok mikroorganizma tanımlanmaktadır. Tek koloni,
çeşitli tekniklerle çalışılabilen ve karakterize edilebilen daha büyük, homojen bir kültür elde
etmek için taze bir ortama aktarılır. Böyle bir işlemde aseptik teknik kullanılır.
Aseptik Teknikler
Aseptik teknikler (steril teknikler), kültüre herhangi bir ek organizma eklemeden veya kültürle
çevreyi kirletmeden bir kültürü bir kaptan diğerine aktarmak için gerekli işlemler olarak
tanımlanır. Hücre kültürü sırasında steril ortam ve ekipmanın kontaminasyonunu önlemek için
aseptik teknik veya steril teknik kullanılır. Canlı hücre kültürleri ve bu tür kültürler için
kullanılacak reaktifler/ortamlarla çalışırken her zaman steril teknik kullanılmalıdır.
Aseptik tekniğin başarılı olması için koşulların uygun olması gerekir. Bu koşullara aşağıdaki
örnekler verilebilir:
Potansiyel kirleticilerin sayısını azaltmak için çalışma alanı bir antiseptik ile
silinmelidir.
Transfer aletleri steril olmalıdır.
Kültürün veya laboratuvar çalışanının kontaminasyonunun oluşabileceği maruz kalma
süresini en aza indirmek için çalışma hızlı ve verimli bir şekilde gerçekleştirilmelidir.
Aseptik teknikler ve kültür transfer prosedürleri hakkında kapsamlı bilgi sahibi olmak,
mikrobiyolojik kültürlerle çalışmak için bir ön koşuldur.
, Herhangi bir kültür materyaline girmek için kullanmadan önce öze (inoculation loop)
daima ateşten geçirilerek sterilize edilmelidir.
Steril öze kültüre yerleştirilmeden önce daima kültür tüpünün ağzı ateşten
geçirilmelidir. Böylece, önceki transferler sırasında veya başka yollarla yanlışlıkla
tüpün kenarına yakın bir yerde birikmiş olabilecek kirletici hücreler yok edilmiş olur.
İçerisinde mikroorganizmaların bulunduğu bilinen ya da bulunup bulunmadığı kontrol edilecek
olan ortamdan ekim aletleri yardımı ile alınan örneklerin belirli kurallar altında besiyerlerine
aktarılması işlemine ‘’ekim’’ denir.
Seri Dilüsyon
Seyreltme, bir çözeltiyi daha az konsantre hale getirme işlemidir. Mikrobiyolojide, bakteri
konsantrasyonunu belirli bir test yöntemi için gerekli bir konsantrasyona veya bir agar plakasına
kaplandığında sayılması daha kolay olan bir konsantrasyona düşürmek için seri seyreltmeler
kullanılır. Basit bir deyişle, seri seyreltme, ilgili bir seyreltme faktörü ile bir çözeltinin kademeli
olarak seyreltilmesi işlemidir.
Seri seyreltme yönteminin asıl amacı, numunenin seri dilüsyonlarından kültürlenen kolonilerin
sayısını sayarak bilinmeyen bir numunenin konsantrasyonunu (organizma, bakteri, virüs veya
koloni sayısı) tahmin etmektir. Aynı zamanda, bir çözeltinin seyreltmesini yapmak için çok
küçük hacimleri (1-10 μl) pipetlemek zorunda kalmamak için de kullanılır.
Seri seyreltmede, tüm serideki toplam seyreltmeyi hesaplayarak orijinal çözeltideki hücrelerin
konsantrasyonunu hesaplamak daha kolay olacak şekilde hücrelerin yoğunluğu her adımda
azaltılır. Bir numuneyi kontrollü bir şekilde seyrelterek, kolayca sayılabilir sayıda koloniye
sahip inkübe kültür plakaları elde etmek ve numunede bulunan mikroorganizma sayısını
hesaplamak mümkündür.
Seri Seyreltme Formülü/Hesaplamaları
Seri seyreltme, bir numunenin alınması ve bunun damıtılmış su, kültür ortamı veya farklı
dilüsyon sıvıları gibi standart seyreltici hacmiyle seyreltilmesi sürecini içerir. Daha sonra, bir
dizi dökme veya yayma plakası yapmak için her seyreltmenin küçük bir ölçülen hacmi
kullanılır.
Bir numunedeki tahmini hücre/organizma konsantrasyonuna bağlı olarak, seyreltme derecesi
belirlenir. Örneğin aşırı derecede kirli bir ortamdan su numunesi alınırsa seyreltme faktörü
Deneyin Adı: Seri Dilüsyon ve Sayım Yöntemleri
Deneyin amacı: Yayma plak yöntemi ile hücre ekimi yapılması ve sayım yöntemlerinden biri
seçilerek hücrelerin sayılması amaçlanmaktadır.
Teorik Bilgi
Doğada, mikroorganizmalar genellikle karmaşık çoklu türler topluluğu olarak bulunur.
Organizmanın morfolojisini, patojenitesini ve moleküler genomik modelini bilmek için tek bir
türün karakterize edilmesi gerekir. Bir türü karakterize etmek için organizmaları saf biçimde
izole etmeliyiz. Saf kültür veya aksenik kültür, yalnızca bir tür organizma içeren bir kültürdür.
Saf kültürde tek bir organizmanın soyundan gelenlere tür denir. Bir suş tek bir koloni oluşturur.
Koloni, ailenin tüm karakterlerinin aynı kaldığı bir mikroorganizma kümesidir. Saf kültür
tekniklerinin ortaya çıkmasıyla birlikte birçok mikroorganizma tanımlanmaktadır. Tek koloni,
çeşitli tekniklerle çalışılabilen ve karakterize edilebilen daha büyük, homojen bir kültür elde
etmek için taze bir ortama aktarılır. Böyle bir işlemde aseptik teknik kullanılır.
Aseptik Teknikler
Aseptik teknikler (steril teknikler), kültüre herhangi bir ek organizma eklemeden veya kültürle
çevreyi kirletmeden bir kültürü bir kaptan diğerine aktarmak için gerekli işlemler olarak
tanımlanır. Hücre kültürü sırasında steril ortam ve ekipmanın kontaminasyonunu önlemek için
aseptik teknik veya steril teknik kullanılır. Canlı hücre kültürleri ve bu tür kültürler için
kullanılacak reaktifler/ortamlarla çalışırken her zaman steril teknik kullanılmalıdır.
Aseptik tekniğin başarılı olması için koşulların uygun olması gerekir. Bu koşullara aşağıdaki
örnekler verilebilir:
Potansiyel kirleticilerin sayısını azaltmak için çalışma alanı bir antiseptik ile
silinmelidir.
Transfer aletleri steril olmalıdır.
Kültürün veya laboratuvar çalışanının kontaminasyonunun oluşabileceği maruz kalma
süresini en aza indirmek için çalışma hızlı ve verimli bir şekilde gerçekleştirilmelidir.
Aseptik teknikler ve kültür transfer prosedürleri hakkında kapsamlı bilgi sahibi olmak,
mikrobiyolojik kültürlerle çalışmak için bir ön koşuldur.
, Herhangi bir kültür materyaline girmek için kullanmadan önce öze (inoculation loop)
daima ateşten geçirilerek sterilize edilmelidir.
Steril öze kültüre yerleştirilmeden önce daima kültür tüpünün ağzı ateşten
geçirilmelidir. Böylece, önceki transferler sırasında veya başka yollarla yanlışlıkla
tüpün kenarına yakın bir yerde birikmiş olabilecek kirletici hücreler yok edilmiş olur.
İçerisinde mikroorganizmaların bulunduğu bilinen ya da bulunup bulunmadığı kontrol edilecek
olan ortamdan ekim aletleri yardımı ile alınan örneklerin belirli kurallar altında besiyerlerine
aktarılması işlemine ‘’ekim’’ denir.
Seri Dilüsyon
Seyreltme, bir çözeltiyi daha az konsantre hale getirme işlemidir. Mikrobiyolojide, bakteri
konsantrasyonunu belirli bir test yöntemi için gerekli bir konsantrasyona veya bir agar plakasına
kaplandığında sayılması daha kolay olan bir konsantrasyona düşürmek için seri seyreltmeler
kullanılır. Basit bir deyişle, seri seyreltme, ilgili bir seyreltme faktörü ile bir çözeltinin kademeli
olarak seyreltilmesi işlemidir.
Seri seyreltme yönteminin asıl amacı, numunenin seri dilüsyonlarından kültürlenen kolonilerin
sayısını sayarak bilinmeyen bir numunenin konsantrasyonunu (organizma, bakteri, virüs veya
koloni sayısı) tahmin etmektir. Aynı zamanda, bir çözeltinin seyreltmesini yapmak için çok
küçük hacimleri (1-10 μl) pipetlemek zorunda kalmamak için de kullanılır.
Seri seyreltmede, tüm serideki toplam seyreltmeyi hesaplayarak orijinal çözeltideki hücrelerin
konsantrasyonunu hesaplamak daha kolay olacak şekilde hücrelerin yoğunluğu her adımda
azaltılır. Bir numuneyi kontrollü bir şekilde seyrelterek, kolayca sayılabilir sayıda koloniye
sahip inkübe kültür plakaları elde etmek ve numunede bulunan mikroorganizma sayısını
hesaplamak mümkündür.
Seri Seyreltme Formülü/Hesaplamaları
Seri seyreltme, bir numunenin alınması ve bunun damıtılmış su, kültür ortamı veya farklı
dilüsyon sıvıları gibi standart seyreltici hacmiyle seyreltilmesi sürecini içerir. Daha sonra, bir
dizi dökme veya yayma plakası yapmak için her seyreltmenin küçük bir ölçülen hacmi
kullanılır.
Bir numunedeki tahmini hücre/organizma konsantrasyonuna bağlı olarak, seyreltme derecesi
belirlenir. Örneğin aşırı derecede kirli bir ortamdan su numunesi alınırsa seyreltme faktörü
