Tutor weektaak 3 – antistoffen en lymfoïde organen
1. Monoklonale en polyklonale antistoffen
a. Wat is het verschil tussen monoklonale en polyklonale antistoffen?
Een polyklonaal antilichaam (antistof) is een mix van verschillende antilichamen die
allemaal hetzelfde antigeen herkennen, maar wel op verschillende plekken
(epitopen).
Een monoklonaal antilichaam is 1 soort antilichaam (antistof) die specifiek bindt aan
1 epitoop.
b. Hoe worden monoklonale en polyklonale antistoffen gemaakt (zie ook theorieles)?
Polyklonale antilichamen worden gemaakt vanuit proefdieren. Er wordt dan een
antigen, bijvoorbeeld een virus, in het proefdier gespoten. In het proefdier wordt de
immuunreactie opgestart (immunisatie). Het proefdier gaat antilichamen produceren
tegen het antigen (virus). De antilichamen komen in het bloed terecht. Het bloed
wordt vervolgens uit het proefdier gehaald. Hieruit wordt het serum (antiserum)
geïsoleerd, waar de antilichamen daadwerkelijk in zitten. Op deze manier worden
polyklonale antilichamen verkregen.
Monoklonale antilichamen kunnen op 3 manieren worden gemaakt:
- Hybridoma techniek;
, - Phage display;
- Cloning;
c. Wat zijn de voordelen en nadelen van monoklonale en polyklonale antistoffen?
Polyklonale antistoffen;
- Voordeel: makkelijk te maken
- Voordeel: veel binding hoge meting
- Nadeel: minder specifiek
Monoklonale antistoffen;
- Voordeel: heel specifiek
- Nadeel: heel specifiek minder binding lagere meting
- Nadeel: moeilijker te maken duurder
d. Bij een ELISA, gebruik je 2 antilichamen, voor welke zou je de monoklonale en voor
welke de polyklonale antistof gebruiken?
De antilichamen die gebruikt worden voor de specifieke detectie kunnen polyklonaal
of monoklonaal zijn. Monoklonale antilichamen zouden de meeste specificiteit
hebben. Polyklonale antilichamen zijn een heterogene mix van antilichamen die
verschillende epitopen kunnen herkennen.
Antilichamen kunnen ook worden geclassificeerd als primaire of secundaire
reagentia. Primaire antilichamen worden gevormd tegen een bepaald antigeen en
, zijn ongeconjugeerd of ongelabeld, terwijl secundaire antilichamen worden gevormd
tegen primaire antilichamen. Op deze manier herkennen secundaire antilichamen de
antistoffen van een bepaalde diersoort en zijn geconjugeerd met biotine of een ander
enzym zoals alkalisch fosfatase of horseradish peroxidase (HRP). Sommige secundaire
antilichamen zijn geconjugeerd aan een fluorescerende stof, zoals de Alexa Fluor of
DyLight Fluor familie. Deze worden vaak gebruikt voor de detectie van proteïnes in
IHC. Proteïneconcentratie wordt meestal gemeten door densitometrie, hierbij
correleert de intensiteit van kleuring met de hoeveelheid gemerkt proteïne.
Het opsporen gebeurt door binding van de eiwitten met antilichamen die gelabeld
zijn. Dit wil zeggen dat ze chemisch gekoppeld worden aan een enzym zoals
peroxidase dat via een of meer tussenstappen een kleurstof doet ontstaan. Hoe meer
van de te detecteren stof aanwezig was, hoe meer enzymwerking gebonden wordt
en hoe meer kleurstof er uiteindelijk ontstaat.
Er kan ook gebruikgemaakt worden van twee verschillende antilichamen (secundaire
detectie):
1. Sandwich ELISA: Een ongemerkt antilichaam wordt voor de stof die gemeten wil
worden gepipetteerd in de welletjes.
2. Indirecte ELISA: Een gelabeld antilichaam tegen het constante gedeelte het eerste
antilichaam. ("Constant" slaat hier op een gedeelte van de "zware keten" die elk
antilichaam van dat type (bijvoorbeeld IgG) gemeen heeft).
Het eerste antilichaam kan bijvoorbeeld afkomstig zijn van een konijn waarbij een
immuunreactie is opgewekt tegen de gezochte stof (door boostervaccinatie met die
stof). Het tweede antilichaam is afkomstig van een ander dier (bijvoorbeeld een ezel).
Het gebruik van meerdere antilichamen levert aanzienlijke voordelen op:
- Signaalversterking: Per eerste antilichaam kunnen meerdere tweede
antilichamen binden.
- Schaalvergroting: Het tweede antilichaam hoeft alleen maar specifiek tegen
de donor van het eerste te zijn, niet zozeer tegen een bepaalde stof,
waardoor productie veel grootschaliger en goedkoper kan.
e. Waar moet je op letten als je een antilichaam moet kiezen voor
immuunhistochemie?
Dat het 2e antilichaam op het 1e antilichaam ‘past’ en dat het 1e antilichaam aan het
eiwit/antigeen bindt.
1. Monoklonale en polyklonale antistoffen
a. Wat is het verschil tussen monoklonale en polyklonale antistoffen?
Een polyklonaal antilichaam (antistof) is een mix van verschillende antilichamen die
allemaal hetzelfde antigeen herkennen, maar wel op verschillende plekken
(epitopen).
Een monoklonaal antilichaam is 1 soort antilichaam (antistof) die specifiek bindt aan
1 epitoop.
b. Hoe worden monoklonale en polyklonale antistoffen gemaakt (zie ook theorieles)?
Polyklonale antilichamen worden gemaakt vanuit proefdieren. Er wordt dan een
antigen, bijvoorbeeld een virus, in het proefdier gespoten. In het proefdier wordt de
immuunreactie opgestart (immunisatie). Het proefdier gaat antilichamen produceren
tegen het antigen (virus). De antilichamen komen in het bloed terecht. Het bloed
wordt vervolgens uit het proefdier gehaald. Hieruit wordt het serum (antiserum)
geïsoleerd, waar de antilichamen daadwerkelijk in zitten. Op deze manier worden
polyklonale antilichamen verkregen.
Monoklonale antilichamen kunnen op 3 manieren worden gemaakt:
- Hybridoma techniek;
, - Phage display;
- Cloning;
c. Wat zijn de voordelen en nadelen van monoklonale en polyklonale antistoffen?
Polyklonale antistoffen;
- Voordeel: makkelijk te maken
- Voordeel: veel binding hoge meting
- Nadeel: minder specifiek
Monoklonale antistoffen;
- Voordeel: heel specifiek
- Nadeel: heel specifiek minder binding lagere meting
- Nadeel: moeilijker te maken duurder
d. Bij een ELISA, gebruik je 2 antilichamen, voor welke zou je de monoklonale en voor
welke de polyklonale antistof gebruiken?
De antilichamen die gebruikt worden voor de specifieke detectie kunnen polyklonaal
of monoklonaal zijn. Monoklonale antilichamen zouden de meeste specificiteit
hebben. Polyklonale antilichamen zijn een heterogene mix van antilichamen die
verschillende epitopen kunnen herkennen.
Antilichamen kunnen ook worden geclassificeerd als primaire of secundaire
reagentia. Primaire antilichamen worden gevormd tegen een bepaald antigeen en
, zijn ongeconjugeerd of ongelabeld, terwijl secundaire antilichamen worden gevormd
tegen primaire antilichamen. Op deze manier herkennen secundaire antilichamen de
antistoffen van een bepaalde diersoort en zijn geconjugeerd met biotine of een ander
enzym zoals alkalisch fosfatase of horseradish peroxidase (HRP). Sommige secundaire
antilichamen zijn geconjugeerd aan een fluorescerende stof, zoals de Alexa Fluor of
DyLight Fluor familie. Deze worden vaak gebruikt voor de detectie van proteïnes in
IHC. Proteïneconcentratie wordt meestal gemeten door densitometrie, hierbij
correleert de intensiteit van kleuring met de hoeveelheid gemerkt proteïne.
Het opsporen gebeurt door binding van de eiwitten met antilichamen die gelabeld
zijn. Dit wil zeggen dat ze chemisch gekoppeld worden aan een enzym zoals
peroxidase dat via een of meer tussenstappen een kleurstof doet ontstaan. Hoe meer
van de te detecteren stof aanwezig was, hoe meer enzymwerking gebonden wordt
en hoe meer kleurstof er uiteindelijk ontstaat.
Er kan ook gebruikgemaakt worden van twee verschillende antilichamen (secundaire
detectie):
1. Sandwich ELISA: Een ongemerkt antilichaam wordt voor de stof die gemeten wil
worden gepipetteerd in de welletjes.
2. Indirecte ELISA: Een gelabeld antilichaam tegen het constante gedeelte het eerste
antilichaam. ("Constant" slaat hier op een gedeelte van de "zware keten" die elk
antilichaam van dat type (bijvoorbeeld IgG) gemeen heeft).
Het eerste antilichaam kan bijvoorbeeld afkomstig zijn van een konijn waarbij een
immuunreactie is opgewekt tegen de gezochte stof (door boostervaccinatie met die
stof). Het tweede antilichaam is afkomstig van een ander dier (bijvoorbeeld een ezel).
Het gebruik van meerdere antilichamen levert aanzienlijke voordelen op:
- Signaalversterking: Per eerste antilichaam kunnen meerdere tweede
antilichamen binden.
- Schaalvergroting: Het tweede antilichaam hoeft alleen maar specifiek tegen
de donor van het eerste te zijn, niet zozeer tegen een bepaalde stof,
waardoor productie veel grootschaliger en goedkoper kan.
e. Waar moet je op letten als je een antilichaam moet kiezen voor
immuunhistochemie?
Dat het 2e antilichaam op het 1e antilichaam ‘past’ en dat het 1e antilichaam aan het
eiwit/antigeen bindt.
