Samenvatting moleculaire biologie technieken
Inhoud
1 Algemene DNA technieken........................................................................................................................ 2
Restrictie enzymen.................................................................................................................................... 2
Gel elektroforese...................................................................................................................................... 3
Nucleïnezuur isolatie................................................................................................................................. 3
Probe labelling.......................................................................................................................................... 4
Denaturatie, renaturatie en hybridisatie................................................................................................... 4
Southern blotting...................................................................................................................................... 6
2 Kloneren van DNA fragmenten.................................................................................................................. 7
Moleculair klonen..................................................................................................................................... 7
Selectie................................................................................................................................................. 7
Expressie vectoren.................................................................................................................................... 8
DNA banken.............................................................................................................................................. 9
3 Polymerase chain reaction PCR................................................................................................................ 10
DNA polymerase..................................................................................................................................... 10
PCR en primer design.............................................................................................................................. 10
Real time PCR (qPCR).............................................................................................................................. 11
4 Genome sequencing................................................................................................................................ 13
Chain termination sequancing (Sanger methode)................................................................................... 13
Introductie in nest generation sequencing.............................................................................................. 16
Assembly van DNA sequenties................................................................................................................ 16
5 Opsporen van genen en functie analyse.................................................................................................. 19
Opsporen van genen............................................................................................................................... 19
SNP’s als genetische markers.................................................................................................................. 20
Functiebepaling van genen..................................................................................................................... 20
1
,1 Algemene DNA technieken
Restrictie nucleases
Nucleases zijn eiwitten die DNA afbreken.
Exonucleases = aan de buitenkant van het DNA. Nucleotiden verwijderen vanaf de 3’ einden.
Endonucleases = knipt midden in de streng DNA.
Verder zijn er nog meer soorten nucleases:
Exo- en endo nucleases
DNA en RNA nucleases
ss en ds nucleases
Specifiek en aspecifiek
Restrictie enzymen
Speciefieke ds DNA nucleases
Oorspronkelijk voor het onschadelijk maken van viraal DNA (bacteriofaag) voor de bacterie.
Bacterie breek zijn eigen DNA niet af omdat dat DNA op die restrictie sites een A of een C te methyleren.
(-CH3 groep)
De restrictie sequenties zijn palindromisch.
Blunt = stomp knippen. Blunt op blunt plakken gaat altijd. De uiteinde moeten toevallig bij elkaar in de
buurt komen, ligase kan ze niet bij elkaar zoeken.
Stickey = overhang. Dit plakt efficiënter.
5’ overhang = wanneer het uiteinde dat uitsteekt de 5’ kant is.
3’ overhang = wanneer het uiteinde dat uitsteekt de 3’ kant is.
5’-TGTAG AATTCAGGC-3‘ -> 5’overhang
3’-ACATCTTAA GTCCG-5’
Fragmenten met dezelfde overhang kunnen worden verbonden. De restrictie sequentie hoeftt niet
volledig overeen te komen, wel de basen!
Trucje om te kijken of restrictie enzymen compatibel zijn: dezelfde knipplaats, dus dezelfde plek vanaf het
midden gezien? (Daarnaast kan het nog voorkomen als ze deze niet hebben, ze wel ligeren!)
Let daarbij ook op de polariteit.
Isoschizomeren = Verschillende enzymen met dezelfde
herkenningssequentie.
Bovendien dezelfde manier van knippen. Kan handig zijn als één
van beiden geschikter is voor de gekozen reactiecondities
(buffersamenstelling).
Neo-isoschizomeren = Verschillende enzymen met dezelfde
herkenningssequentie.
Echter verschillende manier van knippen.
DNA openknippen met restrictie-enzymen -> toevoegen DNA molecuul -> Ligase sluit de strengen.
Ligase herstelt de fosfodiester binding.
2
, Gel elektroforese
Agarose bestaat uit polymeren disachariden
Loadingbuffer bevat
- Glycerol/ficol: hiermee wordt het monster verzwaard.
- Broomfenol blauw: indicator voor de gel, loopt mee met
ongeveer 500 bp.
- Orange G: Indicator, loopt mee met 100 bp.
Laag percentage agarose in de gel is goed voor grote moleculen.
Ethidiumbromide of SYBR Safe in de gel bindt aan het DNA.
Pulse-field = molecuul laten zigzaggen omdat de moleculen te groot
zijn en het anders heel veel tijd kost.
De DNA fragmenten moeten zich steeds opnieuw richten, dit remt
af.
PAGE Polyacrylamide gel electroforese
Veel hogere dichtheid dan agarose (scheiding op één nucleotide
nauwkeurig)
Eiwitscheiding
Verticaal i.p.v. horizontaal.
Nucleïnezuur isolatie
Mini-prep: kleinschalige isolatie van plasmiden uit E.coli.
Lysosoom en EDTA(inact. Nucleases) = verzwakken bacteriële celwand. EDTA vangt calcium en magnesium
weg.
Lyseren van cellen met
- SDS: denatureert eiwitten en lost membranen op.
- NaOH laat DNA strengen uit elkaar vallen.
- Extra stap NaOH om plasmiden te scheiden van chromosomaal DNA.
Neutralisatie van lysaat met K-acetaat.
Eiwitten extraheren met fenol.
Ethanol/isopropanol concentreren DNA en verwijderen zouten.
DNA zuivering d.m.v. fenol extractie principe 1 Principe 2: D.m.v. een kolom
Bij principe 2 wordt in plaats van de cel compartimenten, het
DNA selectief verwijderd.
RNA verijderen kan op dezelfde manier als DNA maar RNA is zeer instabiel en RNase is zeer stabiel.
3
Inhoud
1 Algemene DNA technieken........................................................................................................................ 2
Restrictie enzymen.................................................................................................................................... 2
Gel elektroforese...................................................................................................................................... 3
Nucleïnezuur isolatie................................................................................................................................. 3
Probe labelling.......................................................................................................................................... 4
Denaturatie, renaturatie en hybridisatie................................................................................................... 4
Southern blotting...................................................................................................................................... 6
2 Kloneren van DNA fragmenten.................................................................................................................. 7
Moleculair klonen..................................................................................................................................... 7
Selectie................................................................................................................................................. 7
Expressie vectoren.................................................................................................................................... 8
DNA banken.............................................................................................................................................. 9
3 Polymerase chain reaction PCR................................................................................................................ 10
DNA polymerase..................................................................................................................................... 10
PCR en primer design.............................................................................................................................. 10
Real time PCR (qPCR).............................................................................................................................. 11
4 Genome sequencing................................................................................................................................ 13
Chain termination sequancing (Sanger methode)................................................................................... 13
Introductie in nest generation sequencing.............................................................................................. 16
Assembly van DNA sequenties................................................................................................................ 16
5 Opsporen van genen en functie analyse.................................................................................................. 19
Opsporen van genen............................................................................................................................... 19
SNP’s als genetische markers.................................................................................................................. 20
Functiebepaling van genen..................................................................................................................... 20
1
,1 Algemene DNA technieken
Restrictie nucleases
Nucleases zijn eiwitten die DNA afbreken.
Exonucleases = aan de buitenkant van het DNA. Nucleotiden verwijderen vanaf de 3’ einden.
Endonucleases = knipt midden in de streng DNA.
Verder zijn er nog meer soorten nucleases:
Exo- en endo nucleases
DNA en RNA nucleases
ss en ds nucleases
Specifiek en aspecifiek
Restrictie enzymen
Speciefieke ds DNA nucleases
Oorspronkelijk voor het onschadelijk maken van viraal DNA (bacteriofaag) voor de bacterie.
Bacterie breek zijn eigen DNA niet af omdat dat DNA op die restrictie sites een A of een C te methyleren.
(-CH3 groep)
De restrictie sequenties zijn palindromisch.
Blunt = stomp knippen. Blunt op blunt plakken gaat altijd. De uiteinde moeten toevallig bij elkaar in de
buurt komen, ligase kan ze niet bij elkaar zoeken.
Stickey = overhang. Dit plakt efficiënter.
5’ overhang = wanneer het uiteinde dat uitsteekt de 5’ kant is.
3’ overhang = wanneer het uiteinde dat uitsteekt de 3’ kant is.
5’-TGTAG AATTCAGGC-3‘ -> 5’overhang
3’-ACATCTTAA GTCCG-5’
Fragmenten met dezelfde overhang kunnen worden verbonden. De restrictie sequentie hoeftt niet
volledig overeen te komen, wel de basen!
Trucje om te kijken of restrictie enzymen compatibel zijn: dezelfde knipplaats, dus dezelfde plek vanaf het
midden gezien? (Daarnaast kan het nog voorkomen als ze deze niet hebben, ze wel ligeren!)
Let daarbij ook op de polariteit.
Isoschizomeren = Verschillende enzymen met dezelfde
herkenningssequentie.
Bovendien dezelfde manier van knippen. Kan handig zijn als één
van beiden geschikter is voor de gekozen reactiecondities
(buffersamenstelling).
Neo-isoschizomeren = Verschillende enzymen met dezelfde
herkenningssequentie.
Echter verschillende manier van knippen.
DNA openknippen met restrictie-enzymen -> toevoegen DNA molecuul -> Ligase sluit de strengen.
Ligase herstelt de fosfodiester binding.
2
, Gel elektroforese
Agarose bestaat uit polymeren disachariden
Loadingbuffer bevat
- Glycerol/ficol: hiermee wordt het monster verzwaard.
- Broomfenol blauw: indicator voor de gel, loopt mee met
ongeveer 500 bp.
- Orange G: Indicator, loopt mee met 100 bp.
Laag percentage agarose in de gel is goed voor grote moleculen.
Ethidiumbromide of SYBR Safe in de gel bindt aan het DNA.
Pulse-field = molecuul laten zigzaggen omdat de moleculen te groot
zijn en het anders heel veel tijd kost.
De DNA fragmenten moeten zich steeds opnieuw richten, dit remt
af.
PAGE Polyacrylamide gel electroforese
Veel hogere dichtheid dan agarose (scheiding op één nucleotide
nauwkeurig)
Eiwitscheiding
Verticaal i.p.v. horizontaal.
Nucleïnezuur isolatie
Mini-prep: kleinschalige isolatie van plasmiden uit E.coli.
Lysosoom en EDTA(inact. Nucleases) = verzwakken bacteriële celwand. EDTA vangt calcium en magnesium
weg.
Lyseren van cellen met
- SDS: denatureert eiwitten en lost membranen op.
- NaOH laat DNA strengen uit elkaar vallen.
- Extra stap NaOH om plasmiden te scheiden van chromosomaal DNA.
Neutralisatie van lysaat met K-acetaat.
Eiwitten extraheren met fenol.
Ethanol/isopropanol concentreren DNA en verwijderen zouten.
DNA zuivering d.m.v. fenol extractie principe 1 Principe 2: D.m.v. een kolom
Bij principe 2 wordt in plaats van de cel compartimenten, het
DNA selectief verwijderd.
RNA verijderen kan op dezelfde manier als DNA maar RNA is zeer instabiel en RNase is zeer stabiel.
3
