HCO13, quantification of T-cell dynamics in health and disease
Halfwaardetijd T cel, als je verschillende immunologen vraagt hoelang naïeve T cellen leven, zegt de
een 2 weken, terwijl de ander 20 jaar zegt. Als je niet weet hoelang naïeve T cellen leven, hoe weet je
dan of het verstoord is bij zaken zoals HIV infectie, leukemie of na een stamcel transplantatie?
Probleem, je kan de overleving van T cellen niet gemakkelijk meten omdat je een lymfocyt dan vanaf
het moment van ontstaan in de thymus tot aan zijn dood moet volgen. Naïeve T cellen verplaatsen
zich door het lichaam en het is dus heel moeilijk om dit te volgen.
Extrapolatie, veel verwarring op het gebied van T cellen komt door de verwarring of het over muizen
of mensen gaat. Het immuunsysteem van muizen komt namelijk erg overeen met dan van ons, maar
er zitten een paar essentiële verschillen tussen.
T cel productie, mensen hebben
proberen te schatten hoe snel naïeve
T cellen gevormd worden door T cel
reconstitutie te volgen bij kinderen
en jongvolwassenen die
chemotherapie zijn ondergaan.
Rechts is te zien dat je veel T cellen
verliest door chemotherapie en dat het opnieuw aanvullen van de T cellen bij een kind veel sneller
gaat dan bij een jongvolwassene. We denken dat dit komt doordat de thymus in kinderen nog heel
actief is, terwijl dat bij jongvolwassene al niet meer het geval is. Uit de helling van de grafiek zou je
kunnen achterhalen hoe snel T cellen geproduceerd worden, maar di tis niet echt een natuurlijke
setting. Daarbij kan het dat je de proliferatie onderschat als je de helling neemt, doordat je naar de
netto toename van CD4 cellen kijkt en niet strikt naar de proliferatie ervan. Er kunnen ook cellen
doodgaan tijdens de reconstitutie. Daarbij is het ook mogelijk dat je juist een overschatting maakt,
doordat de cellen weinig competitie ervaren, aangezien er maar weinig zijn.
T cel verlies, in een ander onderzoek is gekeken naar patiënten
met veel chromosoomschade in hun T cellen vanwege zware
bestraling (tegen kanker). Ze konden het aantal cellen met
chromosomale schade volgen en bekijken hoe snel deze verloren
gingen in de patiënten. Op deze manier kan je achterhalen hoe
snel T cellen doodgaan. Het bleek dat naïeve T cellen met schade
veel minder snel afnamen dan geheugen T cellen. Dit suggereert
dat geheugencellen sneller verloren gaan dan naïeve T cellen. Dit
was baanbrekend want tot dit onderzoek dacht iedereen dat
geheugen in langlevende cellen opgeslagen zat. Lange termijn
geheugen wordt dus ‘bewaard’ door cellen die relatief kort leven, maar op tijd delen om genoeg
cellen te genereren en het geheugen dus te behouden. Het probleem is echter dat je ook nu met een
verstoorde situatie te maken hebt door bestraling. Cellen zijn namelijk beschadigd en daarnaast zijn
de aantallen ook nog eens laag. We weten ondertussen echter dat het klopt dat geheugencellen
sneller doodgaan dan naïeve cellen.
Onverstoorde situatie, je wilt T cel dynamiek het liefst bestuderen in onverstoorde situaties. Er zijn
een paar statische en dynamische markers voor T cel turnover:
- Statische marker, ze meten op één bepaald moment in de tijd hoeveel cellen bijvoorbeeld
aan het prolifereren zijn.
o Ki67-expressie, wordt gebruikt als marker voor cellen die zich in de G1, S, G2 of M
fase bevinden en dus aan het delen zijn.
o Annexin V staining, wordt gebruik om celdood te meten.
- Dynamische marker, volgt het cel gedrag over de tijd. Er zijn 2 soorten:
o Natuurlijke markers, komen van nature in de cel voor:
▪ T cel telomeer lengte
, ▪ TREC content
o Labelling, is een niet-natuurlijke manier van
markeren doordat je een label toevoegt:
▪ (CFSE labelling)
▪ BrdU labelling
▪ Stable isotope labelling, interfereert als
enige niet met het dier zelf (niet met zijn
levensverwachting, noch met de T cellen).
Gemiddelde telomeer lengte, in het vorige HCO is al aan bod
gekomen dat de telomeren van naïeve T cellen gemiddeld langer
zijn dan die van geheugencellen. Dit is logisch want geheugencellen
delen ook meer, maar het rare is dat de twee lijnen parallel lopen.
Dit is te verklaren doordat naïeve T cellen kunnen differentiëren tot
geheugen T cellen en dus hun lange telomeren in de geheugen T cel pool kunnen stoppen. Terwijl je
denkt dat telomeer lengte je iets vertelt over proliferatie, vertelt het dus juist iets over de combinatie
van proliferatie en input (van de naïeve pool in geheugen pool).
TRECs, er werd altijd gedacht dat average TREC content een goede maat was voor thymus output. In
het vorige HCO is echter gebleken dat het verstoren van de thymus output vrij weinig invloed heeft
op de TREC content. T cel proliferatie heeft daarentegen een groot effect op de TREC content. De
afgenomen TREC content in HIV patiënten komt dan ook waarschijnlijk door een toename in
proliferatie.
We moeten dus heel erg behoedzaam zijn bij deze twee markers en hebben eigenlijk ook
andere markers nodig.
BrdU labelling, is een dynamische marker die we wel op dieren toepassen, maar niet op
de mens, aangezien het giftig is. BrdU staat voor 5-bromo-2’-deoxyuridine en dat is een
nucleoside analoog, waardoor die ingebouwd kan worden in het DNA i.p.v. thymidine.
Door BrdU antilichamen toe te voegen aan een weefsel dat je met BrdU gelabeld hebt,
kan je het percentage cellen dat BrdU ingebouwd heeft meten. Hiermee kan bepalen of
cellen veel geprolifereerd hebben of niet. Dit doe je middels FACS analyse. Zo zie je
rechtsonder resultaten van Kovacs et al. 2001 weergegeven. Op de Y-as staat het aantal
BrdU positieve cellen en je kan zien dat na 24 uur 27% BrdU positief is. Wat de
onderzoekers hier gedaan hebben, is een lijn trekken en alles daaronder is BrdU negatief,
terwijl alles daarboven BrdU
positief is. Je volgt dus niet de
exacte mate van BrdU
incorporatie maar verdeelt je
populatie in BrdU positief en
negatief. In de rechter grafiek
is de hoeveelheid BrdU
positieve cellen gevolgd voor
een bepaalde periode aan tijd.
Je ziet dat de monocyten een hoog percentage BrdU positieve cellen bevatten en dat betekent
dat ze erg snel delen. Dat is ook de reden dat het snel afneemt zodra de labelling voorbij is. Je
ziet dat de CD4, CD8 en B cellen minder dynamisch zijn. Intuïtief zou je waarschijnlijk zeggen dat
de helling door p (proliferation rate) bepaald wordt en de afname door d (death rate). Dit is
echter niet zo en dat is met een model aan te tonen.
BrdU labelling model, links is schematisch weergegeven hoe BrdU labelling van gang gaat. Bij
celdeling worden nieuwe strengen gemaakt langs twee oude strengen, waardoor in beide
dochtercellen BrdU terechtkomt (groen). Voor het model geldt het volgende:
- Tijdens labelen, elke unlabeled cel (U) die deelt in de labelperiode resulteert in 2 gelabelde
cellen (L) (U → 2L). Elke gelabelde cel resulteert ook in 2 gelabelde cellen (L → 2L). Productie
vindt plaats met rate p en celdood met rate d. Verder is het nog belangrijk om te weten dat
Halfwaardetijd T cel, als je verschillende immunologen vraagt hoelang naïeve T cellen leven, zegt de
een 2 weken, terwijl de ander 20 jaar zegt. Als je niet weet hoelang naïeve T cellen leven, hoe weet je
dan of het verstoord is bij zaken zoals HIV infectie, leukemie of na een stamcel transplantatie?
Probleem, je kan de overleving van T cellen niet gemakkelijk meten omdat je een lymfocyt dan vanaf
het moment van ontstaan in de thymus tot aan zijn dood moet volgen. Naïeve T cellen verplaatsen
zich door het lichaam en het is dus heel moeilijk om dit te volgen.
Extrapolatie, veel verwarring op het gebied van T cellen komt door de verwarring of het over muizen
of mensen gaat. Het immuunsysteem van muizen komt namelijk erg overeen met dan van ons, maar
er zitten een paar essentiële verschillen tussen.
T cel productie, mensen hebben
proberen te schatten hoe snel naïeve
T cellen gevormd worden door T cel
reconstitutie te volgen bij kinderen
en jongvolwassenen die
chemotherapie zijn ondergaan.
Rechts is te zien dat je veel T cellen
verliest door chemotherapie en dat het opnieuw aanvullen van de T cellen bij een kind veel sneller
gaat dan bij een jongvolwassene. We denken dat dit komt doordat de thymus in kinderen nog heel
actief is, terwijl dat bij jongvolwassene al niet meer het geval is. Uit de helling van de grafiek zou je
kunnen achterhalen hoe snel T cellen geproduceerd worden, maar di tis niet echt een natuurlijke
setting. Daarbij kan het dat je de proliferatie onderschat als je de helling neemt, doordat je naar de
netto toename van CD4 cellen kijkt en niet strikt naar de proliferatie ervan. Er kunnen ook cellen
doodgaan tijdens de reconstitutie. Daarbij is het ook mogelijk dat je juist een overschatting maakt,
doordat de cellen weinig competitie ervaren, aangezien er maar weinig zijn.
T cel verlies, in een ander onderzoek is gekeken naar patiënten
met veel chromosoomschade in hun T cellen vanwege zware
bestraling (tegen kanker). Ze konden het aantal cellen met
chromosomale schade volgen en bekijken hoe snel deze verloren
gingen in de patiënten. Op deze manier kan je achterhalen hoe
snel T cellen doodgaan. Het bleek dat naïeve T cellen met schade
veel minder snel afnamen dan geheugen T cellen. Dit suggereert
dat geheugencellen sneller verloren gaan dan naïeve T cellen. Dit
was baanbrekend want tot dit onderzoek dacht iedereen dat
geheugen in langlevende cellen opgeslagen zat. Lange termijn
geheugen wordt dus ‘bewaard’ door cellen die relatief kort leven, maar op tijd delen om genoeg
cellen te genereren en het geheugen dus te behouden. Het probleem is echter dat je ook nu met een
verstoorde situatie te maken hebt door bestraling. Cellen zijn namelijk beschadigd en daarnaast zijn
de aantallen ook nog eens laag. We weten ondertussen echter dat het klopt dat geheugencellen
sneller doodgaan dan naïeve cellen.
Onverstoorde situatie, je wilt T cel dynamiek het liefst bestuderen in onverstoorde situaties. Er zijn
een paar statische en dynamische markers voor T cel turnover:
- Statische marker, ze meten op één bepaald moment in de tijd hoeveel cellen bijvoorbeeld
aan het prolifereren zijn.
o Ki67-expressie, wordt gebruikt als marker voor cellen die zich in de G1, S, G2 of M
fase bevinden en dus aan het delen zijn.
o Annexin V staining, wordt gebruik om celdood te meten.
- Dynamische marker, volgt het cel gedrag over de tijd. Er zijn 2 soorten:
o Natuurlijke markers, komen van nature in de cel voor:
▪ T cel telomeer lengte
, ▪ TREC content
o Labelling, is een niet-natuurlijke manier van
markeren doordat je een label toevoegt:
▪ (CFSE labelling)
▪ BrdU labelling
▪ Stable isotope labelling, interfereert als
enige niet met het dier zelf (niet met zijn
levensverwachting, noch met de T cellen).
Gemiddelde telomeer lengte, in het vorige HCO is al aan bod
gekomen dat de telomeren van naïeve T cellen gemiddeld langer
zijn dan die van geheugencellen. Dit is logisch want geheugencellen
delen ook meer, maar het rare is dat de twee lijnen parallel lopen.
Dit is te verklaren doordat naïeve T cellen kunnen differentiëren tot
geheugen T cellen en dus hun lange telomeren in de geheugen T cel pool kunnen stoppen. Terwijl je
denkt dat telomeer lengte je iets vertelt over proliferatie, vertelt het dus juist iets over de combinatie
van proliferatie en input (van de naïeve pool in geheugen pool).
TRECs, er werd altijd gedacht dat average TREC content een goede maat was voor thymus output. In
het vorige HCO is echter gebleken dat het verstoren van de thymus output vrij weinig invloed heeft
op de TREC content. T cel proliferatie heeft daarentegen een groot effect op de TREC content. De
afgenomen TREC content in HIV patiënten komt dan ook waarschijnlijk door een toename in
proliferatie.
We moeten dus heel erg behoedzaam zijn bij deze twee markers en hebben eigenlijk ook
andere markers nodig.
BrdU labelling, is een dynamische marker die we wel op dieren toepassen, maar niet op
de mens, aangezien het giftig is. BrdU staat voor 5-bromo-2’-deoxyuridine en dat is een
nucleoside analoog, waardoor die ingebouwd kan worden in het DNA i.p.v. thymidine.
Door BrdU antilichamen toe te voegen aan een weefsel dat je met BrdU gelabeld hebt,
kan je het percentage cellen dat BrdU ingebouwd heeft meten. Hiermee kan bepalen of
cellen veel geprolifereerd hebben of niet. Dit doe je middels FACS analyse. Zo zie je
rechtsonder resultaten van Kovacs et al. 2001 weergegeven. Op de Y-as staat het aantal
BrdU positieve cellen en je kan zien dat na 24 uur 27% BrdU positief is. Wat de
onderzoekers hier gedaan hebben, is een lijn trekken en alles daaronder is BrdU negatief,
terwijl alles daarboven BrdU
positief is. Je volgt dus niet de
exacte mate van BrdU
incorporatie maar verdeelt je
populatie in BrdU positief en
negatief. In de rechter grafiek
is de hoeveelheid BrdU
positieve cellen gevolgd voor
een bepaalde periode aan tijd.
Je ziet dat de monocyten een hoog percentage BrdU positieve cellen bevatten en dat betekent
dat ze erg snel delen. Dat is ook de reden dat het snel afneemt zodra de labelling voorbij is. Je
ziet dat de CD4, CD8 en B cellen minder dynamisch zijn. Intuïtief zou je waarschijnlijk zeggen dat
de helling door p (proliferation rate) bepaald wordt en de afname door d (death rate). Dit is
echter niet zo en dat is met een model aan te tonen.
BrdU labelling model, links is schematisch weergegeven hoe BrdU labelling van gang gaat. Bij
celdeling worden nieuwe strengen gemaakt langs twee oude strengen, waardoor in beide
dochtercellen BrdU terechtkomt (groen). Voor het model geldt het volgende:
- Tijdens labelen, elke unlabeled cel (U) die deelt in de labelperiode resulteert in 2 gelabelde
cellen (L) (U → 2L). Elke gelabelde cel resulteert ook in 2 gelabelde cellen (L → 2L). Productie
vindt plaats met rate p en celdood met rate d. Verder is het nog belangrijk om te weten dat
