Analyse van nanomaterialen
Aantekeningen les week 1
Mogelijkheden om moleculen uit elkaar te halen. Je kan moleculen scheiden op basis van
verschillende eigenschappen. Op basis van die eigenschap kan je een techniek zoeken. Je
kan dus op grote, oplosbaarheid in water, lading, ligand specificiteit en op basis van iso-
elektrisch punt. Met pH kan je de lading van een molecuul instellen.
Size exclusion chromotography. Hierbij gaan de grote moleculen als eerste uit de kolom
en de kleinste leggen de langste weg af. De scheiding is gebaseerd op de grote van het
molecuul. In feite bindt je niet aan de kolom bij deze techniek, uiteindelijk krijg je ze er altijd
af als je heel lang doorgaat (kan heel lang doorgaan voordat al die kleine moleculen er
doorheen zijn). Dit is geschikt voor biomoleculen welke gevoelig zijn voor pH, de
concentratie van metaal ionen, een overvloed van cofactoren en slechte omgevingsfactoren.
Je hebt hier te maken met hele gevoelige materialen, daarom is het handig dat hij niet bindt
aan de kolom.
Group separations. The components of a sample are separated into two major groups
according to size range. A group separation can be used to remove high- or low-molecular
weight contaminants (such as phenol red from culture fluids) or for desalting and buffer
exchange.
,Je kan de boel op twee manieren uit elkaar halen. Als eerste een
groepsscheiding, hierbij zijn ze gescheiden op grootte (bijvoorbeeld eiwit
en zout, als je eiwit uit cellen haalt dan eindig je vaak met eiwit en zout). Je
kan kijken naar absorptie, eiwitten kan je goed meten bij 280nm. Zouten
kan je dan niet zien, dus je moet een andere detector vinden. In de praktijk
doe je een geleidbaarheid meting, als je zout vrij komt dan krijg je een
toename van geleidbaarheid, hierbij moet je wel een buffer hebben (om de
pH constant te houden). Door de absorptie en de geleidbaarheid te
combineren kan je dit goed meten. Je ziet dat de eiwitten hier groter zijn
dan de zouten. In de curve zitten de grootste eiwitten aan de linker kant
van de grafiek, die komen er dus als eerste uit.
High-resolution fractionation of biomolecules. The components of a
sample are separated according to differences in their molecular size.
High-resolution fractionation can be used to isolate one or more
components, to separate monomers from aggregates, or to perform a
molecular weight distribution analysis. High-resolution SEC is most
suitable for samples that originally contain few components or for samples
that have been partially purified by other chromatography techniques; this
ensures that most of the unwanted proteins of similar size are eliminated.
De tweede manier is hoge resolution fractionation van biomoleculen. Je moet het kolom
volume weten. Stel je hebt 100 ml kolom volume, dan moet je ongeveer 0,5 ml opbrengen.
Je monster moet dus in een heel klein volume zitten.
SEC working principle. De kleine moleculen die gaan in de poriën en de grotere niet. Dit
werkt dus puur op grote. Als je grote bepaling doet, moet je weten dat je met tijd werkt, met
welke grote correspondeert de tijd nou. Hiervoor heb je dus een bepaalde
standaardbepaling. Omdat er geen interactie met de kolom is, maakt het niet uit wat je erin
stopt, dat is hetzelfde. Normaal is het voor elke stof anders.
Zo een SEC balletje heeft poriën met allemaal verschillende groten, die bepaalde verdeling
is bekend. Als je je monster hebt opgebracht gaat de vloeistof van boven naar beneden. De
afstand tussen de bandjes wordt steeds groter, de bandjes worden ook steeds breder, ze
mogen niet te breed worden anders overlappen ze elkaar en dan heb je ze nog niet
gescheiden. Wanneer stop je de scheiding? De kolomlengte, hoe korter hoe beter want als
ze zijn gescheiden is het goed. Kolom lengte is dus heel erg belangrijk, te kort komen ze niet
uit elkaar, als je hem te lang houdt dan wordt het product in teveel fracties verdeeld. Op de
afbeelding met de pieken zie je dat de laatste eigenlijk vrijwel met de kolom vloeistof
meeloopt. Het SEC medium is het loopmiddel. In de poriën zit inmobiel vloeistof, die staat
stil. Het SEC medium bestaat uit een poreuze matrix wat in evenwicht is met de buffer en de
buffer vult de matrix en de ruimte tussen de partikels. De vloeistof in de poriën (stationaire
fase) is in evenwicht met de vloeistof buiten de partikels (mobiele fase). Je hoeft geen
gebruik te maken van verschillende buffers hier om te elueren. 33% is wat er gelijk doorheen
loopt (buiten die balletjes).
, Verdelingscoëfficiënt, als je slaolie pakt en je giet daar water op dan gaat het water onderin
zitten. Stel je hebt zout moleculen in een bak met water, en stel je gooit die bij die sla olie
met water. Dan wacht je even, na verloop van tijd gaan er ook zout moleculen naar de olie.
Maar de oplosbaarheid in olie is slechter dan water. Waarschijnlijk in dit geval 2 moleculen in
olie en 8 zout moleculen in water. Dit druk je uit in de verdelingscoëfficiënt, hier is hij 2/10 en
heet KD. Eigenlijk is dit de evenwichtsconstante. Hierbij gaat het er dus om hoeveel van de
moleculen die over de kolom gaan in de poriën gaat.
KAV = afhankelijk van de grote. Je hebt een soort sigmoidal relatie tussen de KAV en de Log M
(log van de mol massa). Dit is gedeeltelijk lineair en hierbij kan je het bereik van de
fractionering aflezen. Er is een exclusion limit, op het moment dat het rechte gedeelte gaat
afbuigen trek je hem door, alles hierboven wordt niet meer gescheiden. Dat rechte gedeelte
is dus de fractionation range.
Je kan ook gewichtsverdeling analyse doen. Je kan eiwitten gewoon bij 280 nm meten en
dan komen er die piekjes uit. Dan kan je KAV tegen de molmassa uitzetten en dan komt er
ongeveer een rechte lijn uit. De KAV kan je uitreken en dan relateren aan de molmassa.
Dingen die mis kunnen gaan. Je kan dubbele pieken krijgen, dan heb je een slechte
resolutie (dit heeft waarschijnlijk te maken met de lengte kolom, buffer). Leading peaks, dat
iets te vroeg eruit komt (met concentratie te maken hebben). Tailing peaks, moleculen die er
eigenlijk al af hadden moeten komen maar komen er later af, dit is ook een concentratie
dingetje. Late elutie, hierbij krijg je er dus iets uit wat er niet uit moest komen, je kolom is
waarschijnlijk vervuild geweest.
Aantekeningen les week 1
Mogelijkheden om moleculen uit elkaar te halen. Je kan moleculen scheiden op basis van
verschillende eigenschappen. Op basis van die eigenschap kan je een techniek zoeken. Je
kan dus op grote, oplosbaarheid in water, lading, ligand specificiteit en op basis van iso-
elektrisch punt. Met pH kan je de lading van een molecuul instellen.
Size exclusion chromotography. Hierbij gaan de grote moleculen als eerste uit de kolom
en de kleinste leggen de langste weg af. De scheiding is gebaseerd op de grote van het
molecuul. In feite bindt je niet aan de kolom bij deze techniek, uiteindelijk krijg je ze er altijd
af als je heel lang doorgaat (kan heel lang doorgaan voordat al die kleine moleculen er
doorheen zijn). Dit is geschikt voor biomoleculen welke gevoelig zijn voor pH, de
concentratie van metaal ionen, een overvloed van cofactoren en slechte omgevingsfactoren.
Je hebt hier te maken met hele gevoelige materialen, daarom is het handig dat hij niet bindt
aan de kolom.
Group separations. The components of a sample are separated into two major groups
according to size range. A group separation can be used to remove high- or low-molecular
weight contaminants (such as phenol red from culture fluids) or for desalting and buffer
exchange.
,Je kan de boel op twee manieren uit elkaar halen. Als eerste een
groepsscheiding, hierbij zijn ze gescheiden op grootte (bijvoorbeeld eiwit
en zout, als je eiwit uit cellen haalt dan eindig je vaak met eiwit en zout). Je
kan kijken naar absorptie, eiwitten kan je goed meten bij 280nm. Zouten
kan je dan niet zien, dus je moet een andere detector vinden. In de praktijk
doe je een geleidbaarheid meting, als je zout vrij komt dan krijg je een
toename van geleidbaarheid, hierbij moet je wel een buffer hebben (om de
pH constant te houden). Door de absorptie en de geleidbaarheid te
combineren kan je dit goed meten. Je ziet dat de eiwitten hier groter zijn
dan de zouten. In de curve zitten de grootste eiwitten aan de linker kant
van de grafiek, die komen er dus als eerste uit.
High-resolution fractionation of biomolecules. The components of a
sample are separated according to differences in their molecular size.
High-resolution fractionation can be used to isolate one or more
components, to separate monomers from aggregates, or to perform a
molecular weight distribution analysis. High-resolution SEC is most
suitable for samples that originally contain few components or for samples
that have been partially purified by other chromatography techniques; this
ensures that most of the unwanted proteins of similar size are eliminated.
De tweede manier is hoge resolution fractionation van biomoleculen. Je moet het kolom
volume weten. Stel je hebt 100 ml kolom volume, dan moet je ongeveer 0,5 ml opbrengen.
Je monster moet dus in een heel klein volume zitten.
SEC working principle. De kleine moleculen die gaan in de poriën en de grotere niet. Dit
werkt dus puur op grote. Als je grote bepaling doet, moet je weten dat je met tijd werkt, met
welke grote correspondeert de tijd nou. Hiervoor heb je dus een bepaalde
standaardbepaling. Omdat er geen interactie met de kolom is, maakt het niet uit wat je erin
stopt, dat is hetzelfde. Normaal is het voor elke stof anders.
Zo een SEC balletje heeft poriën met allemaal verschillende groten, die bepaalde verdeling
is bekend. Als je je monster hebt opgebracht gaat de vloeistof van boven naar beneden. De
afstand tussen de bandjes wordt steeds groter, de bandjes worden ook steeds breder, ze
mogen niet te breed worden anders overlappen ze elkaar en dan heb je ze nog niet
gescheiden. Wanneer stop je de scheiding? De kolomlengte, hoe korter hoe beter want als
ze zijn gescheiden is het goed. Kolom lengte is dus heel erg belangrijk, te kort komen ze niet
uit elkaar, als je hem te lang houdt dan wordt het product in teveel fracties verdeeld. Op de
afbeelding met de pieken zie je dat de laatste eigenlijk vrijwel met de kolom vloeistof
meeloopt. Het SEC medium is het loopmiddel. In de poriën zit inmobiel vloeistof, die staat
stil. Het SEC medium bestaat uit een poreuze matrix wat in evenwicht is met de buffer en de
buffer vult de matrix en de ruimte tussen de partikels. De vloeistof in de poriën (stationaire
fase) is in evenwicht met de vloeistof buiten de partikels (mobiele fase). Je hoeft geen
gebruik te maken van verschillende buffers hier om te elueren. 33% is wat er gelijk doorheen
loopt (buiten die balletjes).
, Verdelingscoëfficiënt, als je slaolie pakt en je giet daar water op dan gaat het water onderin
zitten. Stel je hebt zout moleculen in een bak met water, en stel je gooit die bij die sla olie
met water. Dan wacht je even, na verloop van tijd gaan er ook zout moleculen naar de olie.
Maar de oplosbaarheid in olie is slechter dan water. Waarschijnlijk in dit geval 2 moleculen in
olie en 8 zout moleculen in water. Dit druk je uit in de verdelingscoëfficiënt, hier is hij 2/10 en
heet KD. Eigenlijk is dit de evenwichtsconstante. Hierbij gaat het er dus om hoeveel van de
moleculen die over de kolom gaan in de poriën gaat.
KAV = afhankelijk van de grote. Je hebt een soort sigmoidal relatie tussen de KAV en de Log M
(log van de mol massa). Dit is gedeeltelijk lineair en hierbij kan je het bereik van de
fractionering aflezen. Er is een exclusion limit, op het moment dat het rechte gedeelte gaat
afbuigen trek je hem door, alles hierboven wordt niet meer gescheiden. Dat rechte gedeelte
is dus de fractionation range.
Je kan ook gewichtsverdeling analyse doen. Je kan eiwitten gewoon bij 280 nm meten en
dan komen er die piekjes uit. Dan kan je KAV tegen de molmassa uitzetten en dan komt er
ongeveer een rechte lijn uit. De KAV kan je uitreken en dan relateren aan de molmassa.
Dingen die mis kunnen gaan. Je kan dubbele pieken krijgen, dan heb je een slechte
resolutie (dit heeft waarschijnlijk te maken met de lengte kolom, buffer). Leading peaks, dat
iets te vroeg eruit komt (met concentratie te maken hebben). Tailing peaks, moleculen die er
eigenlijk al af hadden moeten komen maar komen er later af, dit is ook een concentratie
dingetje. Late elutie, hierbij krijg je er dus iets uit wat er niet uit moest komen, je kolom is
waarschijnlijk vervuild geweest.
