Hoofdstuk 4: Basic Tools of Recombinant DNA
-
- Restrictie-enzymen knippen een palindroom. GTC GAC
- Isoschizomeren zijn enzymen die dezelfde sequentie herkennen op dezelfde plek. Vb. HpaII (C↓CGG) and MspI
(C↓CGG)
- Neoschizomeren zijn isoschizomeren die dezelfde sequentie herkennen op een andere plek. Vb. AatII (GACGT↓C) and
ZraI (GAC↓GTC)
- Plasmiden zijn circulair, extra-chromosomaal DNA. De replicatie is onafhankelijk van de chromosomen. Bevat genen
voor antibiotica resistentie. Heeft 1 of 2 multiple cloning sites.
- Blauw/wit screening. X-gal wordt afgebroken dan wordt het een blauwe kolonie. Wordt een gen in een plasmide
geplaatst in de MCS dan wordt het gen dat B-gal maakt dat X-gal af te breken kapot gemaakt. Hierdoor kan X-gal niet
worden afgebroken. Dit wordt een witte kolonie. Niet elk type stam kun je hiervoor gebruiken. Je hebt hier ook LacZ
omega nodig en dat zit niet in de plasmide. De e.coli mag zelf geen LacZ alpha maken (anders wordt alles blauw)en
moet wel LacZ omega maken.
-
-
Een library is een DNA bank. Een library is een type cel met daarin
DNA van ander organisme. cDNA is dubbelstrengs DNA dat gemaakt
is van mRNA. Al het mRNA wordt geïsoleerd mbv. Oligo dt’s. Hier
wordt cDNA van gemaakt. Dit kan worden gedaan met oligo dt
primers en …… RT verlengt de primer. De C is gemethyleerd. RNAse
wordt toegevoegd om het mRNA te verwijderen. Aan het cDNA
wordt nog een EcoRI adaptors toegevoegd. Dit zorgt voor een sticky
ends. De gemethyleerde C zorgt ervoor dat het cDNA niet geknipt
kan worden door restrictie-enzymen. Dit kan dan in de plasmide
worden geplaatst.
- Een genomisch DNA library is al het DNA. Dit is voor
wanneer je geintereseerd bent in de regulerende sequenties
- Een cDNA library wordt gebruikt om alleen de genen te
hebben en niet al de regulerende sequenties
- cDNA kan op 2 manieren worden gemaakt:
,Poly-T-primers
Random Primers
, Sanger sequencen
454 Pyrosequencing
454 pyrosequencing. Het hele genoom wordt eerst in stukken gemaakt. De fragmenten worden gemengd met een kogeltje met
daar wat olie omheen. Dit wordt gemeng. Hierdoor komt 1 stuk fragment bij 1 kogeltje met olie. Dit wordt gePCR’t. Er zitten nu
heel veel dezelfde fragmenten DNA aan 1 kegeltje. De kegeltjes worden in een welletjes gedaan. Hier wordt vervolgens de
verschillende nucleotiden 1 voor 1 overheen gehaald (A,T,C,G) met een wasstap er tussen. Wanneer 1 van deze nucleotiden
wordt ingebouwd is er een lichtflits.
Wanneer er een nucleotide wordt toegvoegd, komt PPI vrij. Dit wordt omgezet in ATP. Dit wordt gebruikt door luciferase om
luceferin om te zetten in oxyluciferin. Hierbij komt licht vrij.
, Single molecule sequencing. Hierbij
wordt gebruik gemaakt van 1 streng
DNA. Dit zit in 1 welletje. Het
lichtflitsje wordt waargenomen met
een microscoop. Het kan ook worden
gedaan door een mini ion (minion).
-
- Restrictie-enzymen knippen een palindroom. GTC GAC
- Isoschizomeren zijn enzymen die dezelfde sequentie herkennen op dezelfde plek. Vb. HpaII (C↓CGG) and MspI
(C↓CGG)
- Neoschizomeren zijn isoschizomeren die dezelfde sequentie herkennen op een andere plek. Vb. AatII (GACGT↓C) and
ZraI (GAC↓GTC)
- Plasmiden zijn circulair, extra-chromosomaal DNA. De replicatie is onafhankelijk van de chromosomen. Bevat genen
voor antibiotica resistentie. Heeft 1 of 2 multiple cloning sites.
- Blauw/wit screening. X-gal wordt afgebroken dan wordt het een blauwe kolonie. Wordt een gen in een plasmide
geplaatst in de MCS dan wordt het gen dat B-gal maakt dat X-gal af te breken kapot gemaakt. Hierdoor kan X-gal niet
worden afgebroken. Dit wordt een witte kolonie. Niet elk type stam kun je hiervoor gebruiken. Je hebt hier ook LacZ
omega nodig en dat zit niet in de plasmide. De e.coli mag zelf geen LacZ alpha maken (anders wordt alles blauw)en
moet wel LacZ omega maken.
-
-
Een library is een DNA bank. Een library is een type cel met daarin
DNA van ander organisme. cDNA is dubbelstrengs DNA dat gemaakt
is van mRNA. Al het mRNA wordt geïsoleerd mbv. Oligo dt’s. Hier
wordt cDNA van gemaakt. Dit kan worden gedaan met oligo dt
primers en …… RT verlengt de primer. De C is gemethyleerd. RNAse
wordt toegevoegd om het mRNA te verwijderen. Aan het cDNA
wordt nog een EcoRI adaptors toegevoegd. Dit zorgt voor een sticky
ends. De gemethyleerde C zorgt ervoor dat het cDNA niet geknipt
kan worden door restrictie-enzymen. Dit kan dan in de plasmide
worden geplaatst.
- Een genomisch DNA library is al het DNA. Dit is voor
wanneer je geintereseerd bent in de regulerende sequenties
- Een cDNA library wordt gebruikt om alleen de genen te
hebben en niet al de regulerende sequenties
- cDNA kan op 2 manieren worden gemaakt:
,Poly-T-primers
Random Primers
, Sanger sequencen
454 Pyrosequencing
454 pyrosequencing. Het hele genoom wordt eerst in stukken gemaakt. De fragmenten worden gemengd met een kogeltje met
daar wat olie omheen. Dit wordt gemeng. Hierdoor komt 1 stuk fragment bij 1 kogeltje met olie. Dit wordt gePCR’t. Er zitten nu
heel veel dezelfde fragmenten DNA aan 1 kegeltje. De kegeltjes worden in een welletjes gedaan. Hier wordt vervolgens de
verschillende nucleotiden 1 voor 1 overheen gehaald (A,T,C,G) met een wasstap er tussen. Wanneer 1 van deze nucleotiden
wordt ingebouwd is er een lichtflits.
Wanneer er een nucleotide wordt toegvoegd, komt PPI vrij. Dit wordt omgezet in ATP. Dit wordt gebruikt door luciferase om
luceferin om te zetten in oxyluciferin. Hierbij komt licht vrij.
, Single molecule sequencing. Hierbij
wordt gebruik gemaakt van 1 streng
DNA. Dit zit in 1 welletje. Het
lichtflitsje wordt waargenomen met
een microscoop. Het kan ook worden
gedaan door een mini ion (minion).
