18.1 PCR-techniek
PCR = polymerase chain reaction
Een cyclisch proces waarbij een DNA-sequentie die men wil aantonen, het zogenaamde target-DNA,
in vitro wordt vermeerderd waardoor de detectie daarvan sterk wordt vereenvoudigd.
Vanwege deze vermeerdering wordt de PCR daarom ook wel aangeduid als in-vitro-amplificatie
Cyclus: denaturatie -> primerbinding (annealing) -> ketenverlenging
Door herhaling van deze cyclus, neemt de concentratie target-DNA exponentieel toe
Na “n” cycli ontstaan er 2^n moleculen
Iedere stap heeft zijn eigen optimum temperatuur
Thermostabiele DNA-polymerase uit Thermus aquaticus (Taq) heeft het gebruik van de PCR sterk
bevorderd
Doorstaat 90 graden
Taq-DNA-polymerase (Taq-polymerase)
Voor de uitvoering van de PCR zijn in principe twee primers nodig, één voor elk kant van het DNA
Na hybridisatie vindt polymerase plaats van 5’--> 3’
Voor het maken van een primer, is de DNA sequentie nodig van het target-DNA
De complementaire sequenties moeten zeer specifiek zijn
Indien er geen DNA aanwezig is, zullen er geen kopieën worden gemaakt
Indien er wel DNA aanwezig is, zullen er kopieën worden gemaakt, het zogenaamde amplimeer
Aantonen van het amplimeer gebeurt eerst via gel-elektroforese en vervolgens d.m.v. blotting dit
over te brengen op een membraan
Klonen van DNA met een PCR heeft als voordeel dat het eenvoudig, snel, goedkoop en zeer gevoelig
is.
De grote gevoeligheid maakt de test ook erg gevoelig voor contaminatie
Dus zonder strikte maatregelen ontstaan snel vals-positieve resultaten
Methodiek
Alle componenten bevinden zich in een klein reactievaatje
Deze worden geplaatst in een PCR-apparaat
Zogenaamde thermocycler
Dat is een metalen blok met uitsparingen waarin deze vaatjes passen
,Verwarming tot 90 graden denatureert het target DNA, waardoor er 2 afzonderlijke strengen
ontstaan
Vervolgens wordt de temperatuur verlaagd zodat de primers kunnen hybridiseren aan het
target DNA, de annealing
Hierna wordt de temperatuur tot 70 graden verhoogt, waarbij Taq-polymerase de primers
verlengt
Na deze eerste cyclus wordt de temperatuur weer naar 90 graden gebracht
De primers van beide strengen zijn niet gelijk, omdat de nieuwe stregen in tegenovergestelde
richting worden gesynthetiseerd
Na één cyclus, zijn de strengen aan een enkele zijde verlengt
Na “n” cycli is de 2e soort dochtermolecuul het amplimeer. Dit wordt gevormd of vanaf de eerste
dochtermoleculen of vanaf zichzelf
Het aantal amplimeren na “n” cycli bedraagt 2n – (2n + 2)
In werkelijkheid is de opbrengst geringer
Uitvoering
Bij de PCR worden achtereenvolgens 3 temperatuurtrajecten doorgelopen:
90-95
37-55
60-70
De snelle temperatuur wijzigingen en incubatietijden kunnen met een PCR-apparaat worden
ingesteld
Het reactiemedium waaraan het target-DNA is toegevoegd, bestaat uit de volgende stoffen:
Oligonucleotide-primers met een lengte van ongeveer 20 nucleotiden
Vier verschillende nucleotiden (A T G C)
Taq-DNA-polymerase
Buffer met magnesiumchloride, omdat Mg2+ een cofactor is voor het Taq enzym
Aanvullende technieken
Inverse PCR
Een techniek waarbij een onbekend stuk DNA wordt geamplificeerd. Hieraan voorgaand
wordt een bekende sequentie ingebouwd, waarna het circulair wordt gemaakt.
, Nu kan men de uiteinden van de bekende sequentie gebruiken om complementaire primers
te maken.
Hierdoor kan men de onbekende flankerende sequenties vermeerderen en vervolgens
identificeren.
Asymmetrische PCR
Hierbij verschild de concentratie van de twee verschillende primers sterk en ontstaat
uiteindelijk veel ssDNA dat direct gebruikt kan worden voor sequentie-analyse
Aanhangsels aan het 5’-einde van de primers
Deze aanhangsels storen de reactie nauwelijks, maar worden wel tevens geamplificeerd.
Afhankelijk van het doel zijn dit bijvoorbeeld restrictiesites, ribosomale bindingsplaatsen en
promotors.
Gelokaliseerde mutagenese
Doelbewust aangebrachte veranderingen in de primer zijn later terug te vinden in het
amplimeer.
PCR = polymerase chain reaction
Een cyclisch proces waarbij een DNA-sequentie die men wil aantonen, het zogenaamde target-DNA,
in vitro wordt vermeerderd waardoor de detectie daarvan sterk wordt vereenvoudigd.
Vanwege deze vermeerdering wordt de PCR daarom ook wel aangeduid als in-vitro-amplificatie
Cyclus: denaturatie -> primerbinding (annealing) -> ketenverlenging
Door herhaling van deze cyclus, neemt de concentratie target-DNA exponentieel toe
Na “n” cycli ontstaan er 2^n moleculen
Iedere stap heeft zijn eigen optimum temperatuur
Thermostabiele DNA-polymerase uit Thermus aquaticus (Taq) heeft het gebruik van de PCR sterk
bevorderd
Doorstaat 90 graden
Taq-DNA-polymerase (Taq-polymerase)
Voor de uitvoering van de PCR zijn in principe twee primers nodig, één voor elk kant van het DNA
Na hybridisatie vindt polymerase plaats van 5’--> 3’
Voor het maken van een primer, is de DNA sequentie nodig van het target-DNA
De complementaire sequenties moeten zeer specifiek zijn
Indien er geen DNA aanwezig is, zullen er geen kopieën worden gemaakt
Indien er wel DNA aanwezig is, zullen er kopieën worden gemaakt, het zogenaamde amplimeer
Aantonen van het amplimeer gebeurt eerst via gel-elektroforese en vervolgens d.m.v. blotting dit
over te brengen op een membraan
Klonen van DNA met een PCR heeft als voordeel dat het eenvoudig, snel, goedkoop en zeer gevoelig
is.
De grote gevoeligheid maakt de test ook erg gevoelig voor contaminatie
Dus zonder strikte maatregelen ontstaan snel vals-positieve resultaten
Methodiek
Alle componenten bevinden zich in een klein reactievaatje
Deze worden geplaatst in een PCR-apparaat
Zogenaamde thermocycler
Dat is een metalen blok met uitsparingen waarin deze vaatjes passen
,Verwarming tot 90 graden denatureert het target DNA, waardoor er 2 afzonderlijke strengen
ontstaan
Vervolgens wordt de temperatuur verlaagd zodat de primers kunnen hybridiseren aan het
target DNA, de annealing
Hierna wordt de temperatuur tot 70 graden verhoogt, waarbij Taq-polymerase de primers
verlengt
Na deze eerste cyclus wordt de temperatuur weer naar 90 graden gebracht
De primers van beide strengen zijn niet gelijk, omdat de nieuwe stregen in tegenovergestelde
richting worden gesynthetiseerd
Na één cyclus, zijn de strengen aan een enkele zijde verlengt
Na “n” cycli is de 2e soort dochtermolecuul het amplimeer. Dit wordt gevormd of vanaf de eerste
dochtermoleculen of vanaf zichzelf
Het aantal amplimeren na “n” cycli bedraagt 2n – (2n + 2)
In werkelijkheid is de opbrengst geringer
Uitvoering
Bij de PCR worden achtereenvolgens 3 temperatuurtrajecten doorgelopen:
90-95
37-55
60-70
De snelle temperatuur wijzigingen en incubatietijden kunnen met een PCR-apparaat worden
ingesteld
Het reactiemedium waaraan het target-DNA is toegevoegd, bestaat uit de volgende stoffen:
Oligonucleotide-primers met een lengte van ongeveer 20 nucleotiden
Vier verschillende nucleotiden (A T G C)
Taq-DNA-polymerase
Buffer met magnesiumchloride, omdat Mg2+ een cofactor is voor het Taq enzym
Aanvullende technieken
Inverse PCR
Een techniek waarbij een onbekend stuk DNA wordt geamplificeerd. Hieraan voorgaand
wordt een bekende sequentie ingebouwd, waarna het circulair wordt gemaakt.
, Nu kan men de uiteinden van de bekende sequentie gebruiken om complementaire primers
te maken.
Hierdoor kan men de onbekende flankerende sequenties vermeerderen en vervolgens
identificeren.
Asymmetrische PCR
Hierbij verschild de concentratie van de twee verschillende primers sterk en ontstaat
uiteindelijk veel ssDNA dat direct gebruikt kan worden voor sequentie-analyse
Aanhangsels aan het 5’-einde van de primers
Deze aanhangsels storen de reactie nauwelijks, maar worden wel tevens geamplificeerd.
Afhankelijk van het doel zijn dit bijvoorbeeld restrictiesites, ribosomale bindingsplaatsen en
promotors.
Gelokaliseerde mutagenese
Doelbewust aangebrachte veranderingen in de primer zijn later terug te vinden in het
amplimeer.
