H6.1 Verschillen tussen qPCR en
conventionele PCR
Real-time PCR, ofwel quantitative PCR, wordt afgekort tot qPCR.
Bij qPCR wordt de vorming van het PCR product tijdens de PCR reactie gedetecteerd. Er wordt na of
tijdens elke cyclus gekeken of er product gemaakt is.
De producten zijn fluorescerend door binding aan een kleurstof of een probe.
De hoeveelehid product wordt dus real-time gemeten
Voordeel is dat het PCR meten na afloop van de reactie niet meer geanalyseerd hoeft te
worden.
De kans op contaminatie van andere monsters in het lab met PCR producten wordt
ook enorm beperkt, omdat de vaatjes niet meer open hoeven worden gemaakt.
Voordeel van een analyse tijdens de reactie is dat de hoeveelheid product gevormd tijdens
de exponentiële fase van de reactie bepaald kan worden. Kwantificatie wordt een heel stuk
makkelijker van het startmateriaal.
Voordeel is dat er meerdere kleuren gedetecteerd kunnen worden. Door meerdere
producten te labelen, kunnen in één reactie meerdere producten tegelijkertijd gedetecteerd
worden. Hierdoor is het eenvoudig in multiplex-PCR-toepassingen meerdere targets in één
reactie te kwantificeren.
Dit is in tegenstelling tot de conventionele PCR, waarbij het PCR reactiemengsel na 25 tot 45 cycli
wordt geanalyseerd op de vorming van PCR producten.
Dit laatste heet eindpuntsmeting, omdat het PCR product na afloop wordt geanalyseerd
,H6.2 qPCR-detectie is gebaseerd
op fluorescentie
Fluorochromen zijn moleculen die energie in de vorm van licht kunnen opnemen.
In de uitgangspositie bevindt het fluorochroom zich in de grondtoestand, dit is de toestand waarbij
de energie van het molecuul het laagst is.
Het opnemen van licht-energie door fluorochromen noemen we excitatie (in een aangeslagen
toestand brengen) van het molecuul.
Andere benaming is het ‘aanstralen van het fluorochroom’
De aangeslagen toestand
De vrijgekomen energie van het fluorochroom noemen we emissie of uitstralen
In dit hele proces gaat wat energie verloren. Hierdoor zal de kleur (golflengte) van het licht dat het
fluorochroom exciteert anders zijn dan de kleur van het licht dat wordt geëmitteerd
Voorwaarde voor de qPCR is dat de producten gelabeld moeten zijn en dat de hoeveelheid labels in
het vaatje proportioneel is an de hoeveelheid aanwezige producten
Het qPCR is dus een apparaat met een speciaal fluorescentie-excitatie- (lichtbron) en fluorescentie-
detectie gedeelte
Er mag alleen fluorescentie gedetecteerd worden als er ook daadwerkelijk product is. Om hiervoor te
zorgen, wordt er gewerkt met FRET.
Het principe is dat de energie van een fluorochroom naar een ander molecuul kan worden
overgedragen.
Probes die gebruikt worden bevatten daarom naast een fluorochroom ook een quencher. Dit
is letterlijk vertaald een uitdover. Het vangt fluorescentie weg.
Sommige kunnen dit opvangen en omzetten in warmte: blackhole quencher (BHQ)
Andere zetten het om in een niet te meten golflengte
De quencher kan slechts op een bepaald golflengtegebied te werk gaan, dus fluorochroom en
quencher moeten op elkaar afgestemd zijn
In sommige qPCR systemen wordt FRET gebruikt, wat geen gebruik maakt van quenchers, maar van
verschillende fluorochromen etc.
qPCR mechanisme is dus gebaseerd op het principe van een lichtbron en een detector.
, H6.3 Directe qPCR-detectie
methode
Zoals eerder besproken, is detectie gebaseerd op fluorescentie
Voor de directe methode wordt gebruik gemaakt van fluorescerende DNA-intercalerende
kleurstoffen
Een van de meest gebruikte is SYBR-green
Bindt alleen dsDNA
Heeft geen voorkeur voor een sequentie en zal aan elke ontstane product binden, wat tevens
het nadeel is van de directe methode, want ook ongewenste producten, zoals primer-
dimeren binden hieraan
Dus de qPCR methode zal niet zo specifiek zijn als een conventionele PCR methode
Aan het einde wordt een smeltcurve gemaakt. Op deze manier kan gekeken worden of er één of
verschillende producten zijn gemaakt. De smelttemperatuur is afhankelijk van de lengte en
samenstelling van het PCR-product
conventionele PCR
Real-time PCR, ofwel quantitative PCR, wordt afgekort tot qPCR.
Bij qPCR wordt de vorming van het PCR product tijdens de PCR reactie gedetecteerd. Er wordt na of
tijdens elke cyclus gekeken of er product gemaakt is.
De producten zijn fluorescerend door binding aan een kleurstof of een probe.
De hoeveelehid product wordt dus real-time gemeten
Voordeel is dat het PCR meten na afloop van de reactie niet meer geanalyseerd hoeft te
worden.
De kans op contaminatie van andere monsters in het lab met PCR producten wordt
ook enorm beperkt, omdat de vaatjes niet meer open hoeven worden gemaakt.
Voordeel van een analyse tijdens de reactie is dat de hoeveelheid product gevormd tijdens
de exponentiële fase van de reactie bepaald kan worden. Kwantificatie wordt een heel stuk
makkelijker van het startmateriaal.
Voordeel is dat er meerdere kleuren gedetecteerd kunnen worden. Door meerdere
producten te labelen, kunnen in één reactie meerdere producten tegelijkertijd gedetecteerd
worden. Hierdoor is het eenvoudig in multiplex-PCR-toepassingen meerdere targets in één
reactie te kwantificeren.
Dit is in tegenstelling tot de conventionele PCR, waarbij het PCR reactiemengsel na 25 tot 45 cycli
wordt geanalyseerd op de vorming van PCR producten.
Dit laatste heet eindpuntsmeting, omdat het PCR product na afloop wordt geanalyseerd
,H6.2 qPCR-detectie is gebaseerd
op fluorescentie
Fluorochromen zijn moleculen die energie in de vorm van licht kunnen opnemen.
In de uitgangspositie bevindt het fluorochroom zich in de grondtoestand, dit is de toestand waarbij
de energie van het molecuul het laagst is.
Het opnemen van licht-energie door fluorochromen noemen we excitatie (in een aangeslagen
toestand brengen) van het molecuul.
Andere benaming is het ‘aanstralen van het fluorochroom’
De aangeslagen toestand
De vrijgekomen energie van het fluorochroom noemen we emissie of uitstralen
In dit hele proces gaat wat energie verloren. Hierdoor zal de kleur (golflengte) van het licht dat het
fluorochroom exciteert anders zijn dan de kleur van het licht dat wordt geëmitteerd
Voorwaarde voor de qPCR is dat de producten gelabeld moeten zijn en dat de hoeveelheid labels in
het vaatje proportioneel is an de hoeveelheid aanwezige producten
Het qPCR is dus een apparaat met een speciaal fluorescentie-excitatie- (lichtbron) en fluorescentie-
detectie gedeelte
Er mag alleen fluorescentie gedetecteerd worden als er ook daadwerkelijk product is. Om hiervoor te
zorgen, wordt er gewerkt met FRET.
Het principe is dat de energie van een fluorochroom naar een ander molecuul kan worden
overgedragen.
Probes die gebruikt worden bevatten daarom naast een fluorochroom ook een quencher. Dit
is letterlijk vertaald een uitdover. Het vangt fluorescentie weg.
Sommige kunnen dit opvangen en omzetten in warmte: blackhole quencher (BHQ)
Andere zetten het om in een niet te meten golflengte
De quencher kan slechts op een bepaald golflengtegebied te werk gaan, dus fluorochroom en
quencher moeten op elkaar afgestemd zijn
In sommige qPCR systemen wordt FRET gebruikt, wat geen gebruik maakt van quenchers, maar van
verschillende fluorochromen etc.
qPCR mechanisme is dus gebaseerd op het principe van een lichtbron en een detector.
, H6.3 Directe qPCR-detectie
methode
Zoals eerder besproken, is detectie gebaseerd op fluorescentie
Voor de directe methode wordt gebruik gemaakt van fluorescerende DNA-intercalerende
kleurstoffen
Een van de meest gebruikte is SYBR-green
Bindt alleen dsDNA
Heeft geen voorkeur voor een sequentie en zal aan elke ontstane product binden, wat tevens
het nadeel is van de directe methode, want ook ongewenste producten, zoals primer-
dimeren binden hieraan
Dus de qPCR methode zal niet zo specifiek zijn als een conventionele PCR methode
Aan het einde wordt een smeltcurve gemaakt. Op deze manier kan gekeken worden of er één of
verschillende producten zijn gemaakt. De smelttemperatuur is afhankelijk van de lengte en
samenstelling van het PCR-product
