H16 Sequentie-analyse volgens
Maxam-Gilbert en volgens
Sanger
Sequencen: het bepalen van de volgorde DNA-fragmenten via sequentie-analyse
2 methoden:
Chemische degradatiemethode; ssDNA wordt bij een bepaald nucleotide chemisch veranderd
en vervolgens ter plekke geknipt
Biologisch; door Sanger ontwikkeld. Principe is het specifiek beëindigen van een
polymerisatie van een nucleotidenketen door een didesoxyribonucleotiden
Methode van Maxam-Gilbert: de chemische
degradatiemethode
Het fragment waarvan men de nucleotidenvolgorde wil bepalen, wordt eerst aan de 5’-einde
radioactief gelabeld en vervolgens bij 90 graden met DMSO enkelstrengs gemaakt
In het kort, wat er gebeurd is dat er een label wordt toegevoegd aan de 5’-einde aan een nucleotide.
Dit is voor iedere nucleotide anders. Na behandeling wordt deze op die plaats geknipt. Wat er
ontstaat zijn banden van verschillende lengten. Deze moeten op een PAG gel (ureumhoudende
polyacrylamide-gel) gezet, ureum om te voorkomen dat er haarspeldstructuren vormen. Het
beïnvloed wel de snelheid van dit proces.
De gelabelde fragmenten worden zichtbaar na het belichten ervan. Deze kunnen vervolgens uit de
gel worden geïsoleerd voor verdere onderzoek. De niet gelabelde fragmenten storen niet.
Uitvoering chemische degradatiemethode
Het gelabelde DNA moet in gelijke porties verdeeld worden.
Deze porties moeten voorbehandeld worden om ieder met een verschillende chemische reactie te
behandelen om van ieder ssDNA streng maar één base te verwijderen
Voor nabehandeling wordt piperdine gebruikt. Deze verbreekt de suikerfosfaatketen daar waar de
base verwijderd is
Er zijn alleen reacties specifiek voor G en C’s, en niet voor A en T’s
Interpretatie
Er zijn 4 lanen:
G-laan
A/G-laan
C/T-laan
C-laan
Maxam-Gilbert en volgens
Sanger
Sequencen: het bepalen van de volgorde DNA-fragmenten via sequentie-analyse
2 methoden:
Chemische degradatiemethode; ssDNA wordt bij een bepaald nucleotide chemisch veranderd
en vervolgens ter plekke geknipt
Biologisch; door Sanger ontwikkeld. Principe is het specifiek beëindigen van een
polymerisatie van een nucleotidenketen door een didesoxyribonucleotiden
Methode van Maxam-Gilbert: de chemische
degradatiemethode
Het fragment waarvan men de nucleotidenvolgorde wil bepalen, wordt eerst aan de 5’-einde
radioactief gelabeld en vervolgens bij 90 graden met DMSO enkelstrengs gemaakt
In het kort, wat er gebeurd is dat er een label wordt toegevoegd aan de 5’-einde aan een nucleotide.
Dit is voor iedere nucleotide anders. Na behandeling wordt deze op die plaats geknipt. Wat er
ontstaat zijn banden van verschillende lengten. Deze moeten op een PAG gel (ureumhoudende
polyacrylamide-gel) gezet, ureum om te voorkomen dat er haarspeldstructuren vormen. Het
beïnvloed wel de snelheid van dit proces.
De gelabelde fragmenten worden zichtbaar na het belichten ervan. Deze kunnen vervolgens uit de
gel worden geïsoleerd voor verdere onderzoek. De niet gelabelde fragmenten storen niet.
Uitvoering chemische degradatiemethode
Het gelabelde DNA moet in gelijke porties verdeeld worden.
Deze porties moeten voorbehandeld worden om ieder met een verschillende chemische reactie te
behandelen om van ieder ssDNA streng maar één base te verwijderen
Voor nabehandeling wordt piperdine gebruikt. Deze verbreekt de suikerfosfaatketen daar waar de
base verwijderd is
Er zijn alleen reacties specifiek voor G en C’s, en niet voor A en T’s
Interpretatie
Er zijn 4 lanen:
G-laan
A/G-laan
C/T-laan
C-laan
