Virologie Evelien Floor
HC19-20 regulatie van translatie
Translatie
De kleine subunit van het ribosoom is 40S (1 rRNA) en de grote is 60S (3 rRNA), samen is het ribosoom
80S. S is de Svendberg eenheid voor sedimentatie, deze is afhankelijk van massa, vorm en dichtheid
en dus niet optelbaar. tRNA is het substraat voor het ribosoom en bestaat uit een klaverblad structuur
met een anticodon en een aminozuur dat gekoppeld moet worden aan de 3’ kant. tRNAs zijn in feite
de tolken: ze lezen de nucleotiden en brengen de aminozuren.
Tijdens initiatie starten ribosomen bij de cap structuur en scannen richting het 5’ uiteinde voor AUG.
Als een mRNA efficiënt is in het rekruteren van ribosomen, dan kunnen vele ribosomen tegelijk binden.
Dit wordt dan een poly(ribo)soom genoemd. Op een polysoom kunnen ook twee verschillende
eiwitten gemaakt worden door het mechanisme van leaky scanning. Een ander mechanisme hiervoor
is frameshifting waarbij het ribosoom per ongeluk in een ander leesraam terecht komt.
Een polysoom is niet circulair omdat terminatie dan dichtbij de cap plaatsvindt. Dit is onmogelijk omdat
de polyA staart ofwel UTR erg lang is. Circularisatie stabiliseert het mRNA omdat de uiteinden verstopt
worden. Circularisatie vindt plaats door eIF4E, eIF4G en PABP.
Elongatie
60S heeft een A (aminoacyl), P (peptidyl) en E
(exit) site. De peptide zit altijd in de P site, het
volgende aminozuur wordt gebracht door eEF
(eukaryoot elongatie factor) naar de A site.
Hierbij wordt GTP van eEF gehydrolyseerd
waardoor deze los laat. De peptide wordt
vervolgens gekoppeld aan het volgende
aminozuur, hiervoor moet de verbinding van
methionine met het tRNA verbroken zijn. Het
ribosoom verplaats zich dan 1 stap richting de 3’
kant (translocatie) waardoor het ongebonden
tRNA in de exit site komt en dissocieert.
Terminatie
Terminatie van translatie vindt plaats bij een stop codon
(UAA) met behulp van een eRF (eukaryoot release factor).
eRFs binden op de A site en induceren de hydrolyse van
het peptide met het tRNA. De peptide komt dan vrij en
het gehele complex dissocieert. Dit is mogelijk omdat
tRNA en eRF qua structuur erg op elkaar lijken.
Initiatie
Regulatie van translatie vindt plaats bij initiatie, voor
initiatie zijn eIFs (eukaryoot initiatie factor) nodig. In het
cytoplasma komen 40S en 60S in een dynamisch
evenwicht voor, ze assembleren met elkaar ook in
afwezigheid van mRNA. Associatie en dissociatie wordt
beïnvloed door eIF1A en eIF3, beiden binden aan 40S
waardoor associatie met 60S wordt verhinderd. Hieraan
kan echter wel het ternair complex (TC) (eIF2-GTP-Met-
tRNA) binden. eIF2 brengt het tRNA naar 40S als dit
gebonden zit aan GTP.
1
, Virologie Evelien Floor
eIF4G gebonden aan eIF4A bindt aan eIF3 op het gevormde 43S pre-initiatie complex. Ondertussen
bindt eIF4E aan de cap op het mRNA. eIF4G kan echter ook aan eIF4E binden waardoor het pre-initiatie
complex naar het mRNA wordt gebracht. Nu zijn drie belangrijke componenten bij elkaar gebracht:
Met-tRNA, mRNA en een deel van het ribosoom. eIF4A is verantwoordelijk voor de ontwinding van het
mRNA. Tot slot zitten twee kinases Mnk1/2 aan elF4G gebonden, eIF4G brengt Mnk1 naar zo naar zijn
target. eIF4E wordt geforsforyleerd op Ser209 door Mnk1 een eIF4E kinase. Initiatie van translatie wordt
geactiveerd door deze fosforylering.
Het gehele complex gaat vervolgens het mRNA scannen
voor een start codon (AUG). Deze scanning kost ATP en
wordt gemedieerd door eIF4A dat het 5’ UTR ontwindt.
Dit impliceert dat de eerste AUG vanaf de 5’ kant het start
codon zal zijn, er zijn echter uitzonderingen. Als het
initiatie complex gebonden zit aan AUG via Met-tRNA,
vindt hydrolyse plaats van GTP gebonden aan eIF2 door
eIF5. Hierdoor dissociëren alle initiatie factoren. Er is dan
plaats voor de 60S subunit om te associëren.
Belangrijke eukaryote initiatie factoren:
• eIF1: herkent het start codon
• eIF1A: bind 40S
• eIF2: bind Met-tRNA
• eIF4G: adapter eiwit, verbindt:
o eIF4E: bind de cap aan het 5’ uiteinde
o PABP: bind de polyA staart aan het 3’
uiteinde
o Mnk1: eIF4E kinase
o eIF4A: ontwind de 5’ UTR
o eIF3: bind 40S
Kozak sequentie
43S scant vanaf het 5’ uiteinde naar het 3’ uiteinde voor AUG. Gastheer mRNAs hebben een 5’ UTR tot
het start codon van gemiddeld 30-80 nucleotiden. Een viraal 5’ UTR is echter soms groter dan 1200
nucleotiden. De kans dat er in deze UTR een AUG zit is dan erg groot.
De consensussequentie voor initiatie van translatie is: CC R(A/G) CC AUG G, deze sequentie is
verschillend afhankelijk van het organisme. De kozak sequentie wordt herkend door Met-tRNA maar
ook door eIF2 en eIF1. Hoe meer de sequentie op de kozak sequentie lijkt, hoe groter de kans dat het
ribosoom stopt. Als deze sequentie dus afwijkt zal het ribosoom doorgaan met scannen. Een mRNA
met twee kozak sequenties codeert dus voor twee verschillende eiwitten. De hoeveelheid eiwit is
afhankelijk van hoe goed de consensussequentie gelijkend is. Dit proces wordt leaky scanning
genoemd. Dit suggereert echter dat bij een lange UTR geen enkele AUG over wordt geslagen, in de
praktijk gebeurt dit echter wel.
Leaky scanning
Meerdere AUGs op een mRNA liggen vaak ook in
een ander leesraam, beiden eiwitten hebben dan
vaak ook een ander stop codon. Sendai virus
mRNA bevat 5 start codons op positie: 81, 104
(ander leesraam), 114, 183 en 201. Op deze manier
worden uit 1 mRNA 5 eiwitten gemaakt. In
humaan mRNA komt het echter zelden voor dat er
twee verschillende leesramen worden gebruikt.
2
HC19-20 regulatie van translatie
Translatie
De kleine subunit van het ribosoom is 40S (1 rRNA) en de grote is 60S (3 rRNA), samen is het ribosoom
80S. S is de Svendberg eenheid voor sedimentatie, deze is afhankelijk van massa, vorm en dichtheid
en dus niet optelbaar. tRNA is het substraat voor het ribosoom en bestaat uit een klaverblad structuur
met een anticodon en een aminozuur dat gekoppeld moet worden aan de 3’ kant. tRNAs zijn in feite
de tolken: ze lezen de nucleotiden en brengen de aminozuren.
Tijdens initiatie starten ribosomen bij de cap structuur en scannen richting het 5’ uiteinde voor AUG.
Als een mRNA efficiënt is in het rekruteren van ribosomen, dan kunnen vele ribosomen tegelijk binden.
Dit wordt dan een poly(ribo)soom genoemd. Op een polysoom kunnen ook twee verschillende
eiwitten gemaakt worden door het mechanisme van leaky scanning. Een ander mechanisme hiervoor
is frameshifting waarbij het ribosoom per ongeluk in een ander leesraam terecht komt.
Een polysoom is niet circulair omdat terminatie dan dichtbij de cap plaatsvindt. Dit is onmogelijk omdat
de polyA staart ofwel UTR erg lang is. Circularisatie stabiliseert het mRNA omdat de uiteinden verstopt
worden. Circularisatie vindt plaats door eIF4E, eIF4G en PABP.
Elongatie
60S heeft een A (aminoacyl), P (peptidyl) en E
(exit) site. De peptide zit altijd in de P site, het
volgende aminozuur wordt gebracht door eEF
(eukaryoot elongatie factor) naar de A site.
Hierbij wordt GTP van eEF gehydrolyseerd
waardoor deze los laat. De peptide wordt
vervolgens gekoppeld aan het volgende
aminozuur, hiervoor moet de verbinding van
methionine met het tRNA verbroken zijn. Het
ribosoom verplaats zich dan 1 stap richting de 3’
kant (translocatie) waardoor het ongebonden
tRNA in de exit site komt en dissocieert.
Terminatie
Terminatie van translatie vindt plaats bij een stop codon
(UAA) met behulp van een eRF (eukaryoot release factor).
eRFs binden op de A site en induceren de hydrolyse van
het peptide met het tRNA. De peptide komt dan vrij en
het gehele complex dissocieert. Dit is mogelijk omdat
tRNA en eRF qua structuur erg op elkaar lijken.
Initiatie
Regulatie van translatie vindt plaats bij initiatie, voor
initiatie zijn eIFs (eukaryoot initiatie factor) nodig. In het
cytoplasma komen 40S en 60S in een dynamisch
evenwicht voor, ze assembleren met elkaar ook in
afwezigheid van mRNA. Associatie en dissociatie wordt
beïnvloed door eIF1A en eIF3, beiden binden aan 40S
waardoor associatie met 60S wordt verhinderd. Hieraan
kan echter wel het ternair complex (TC) (eIF2-GTP-Met-
tRNA) binden. eIF2 brengt het tRNA naar 40S als dit
gebonden zit aan GTP.
1
, Virologie Evelien Floor
eIF4G gebonden aan eIF4A bindt aan eIF3 op het gevormde 43S pre-initiatie complex. Ondertussen
bindt eIF4E aan de cap op het mRNA. eIF4G kan echter ook aan eIF4E binden waardoor het pre-initiatie
complex naar het mRNA wordt gebracht. Nu zijn drie belangrijke componenten bij elkaar gebracht:
Met-tRNA, mRNA en een deel van het ribosoom. eIF4A is verantwoordelijk voor de ontwinding van het
mRNA. Tot slot zitten twee kinases Mnk1/2 aan elF4G gebonden, eIF4G brengt Mnk1 naar zo naar zijn
target. eIF4E wordt geforsforyleerd op Ser209 door Mnk1 een eIF4E kinase. Initiatie van translatie wordt
geactiveerd door deze fosforylering.
Het gehele complex gaat vervolgens het mRNA scannen
voor een start codon (AUG). Deze scanning kost ATP en
wordt gemedieerd door eIF4A dat het 5’ UTR ontwindt.
Dit impliceert dat de eerste AUG vanaf de 5’ kant het start
codon zal zijn, er zijn echter uitzonderingen. Als het
initiatie complex gebonden zit aan AUG via Met-tRNA,
vindt hydrolyse plaats van GTP gebonden aan eIF2 door
eIF5. Hierdoor dissociëren alle initiatie factoren. Er is dan
plaats voor de 60S subunit om te associëren.
Belangrijke eukaryote initiatie factoren:
• eIF1: herkent het start codon
• eIF1A: bind 40S
• eIF2: bind Met-tRNA
• eIF4G: adapter eiwit, verbindt:
o eIF4E: bind de cap aan het 5’ uiteinde
o PABP: bind de polyA staart aan het 3’
uiteinde
o Mnk1: eIF4E kinase
o eIF4A: ontwind de 5’ UTR
o eIF3: bind 40S
Kozak sequentie
43S scant vanaf het 5’ uiteinde naar het 3’ uiteinde voor AUG. Gastheer mRNAs hebben een 5’ UTR tot
het start codon van gemiddeld 30-80 nucleotiden. Een viraal 5’ UTR is echter soms groter dan 1200
nucleotiden. De kans dat er in deze UTR een AUG zit is dan erg groot.
De consensussequentie voor initiatie van translatie is: CC R(A/G) CC AUG G, deze sequentie is
verschillend afhankelijk van het organisme. De kozak sequentie wordt herkend door Met-tRNA maar
ook door eIF2 en eIF1. Hoe meer de sequentie op de kozak sequentie lijkt, hoe groter de kans dat het
ribosoom stopt. Als deze sequentie dus afwijkt zal het ribosoom doorgaan met scannen. Een mRNA
met twee kozak sequenties codeert dus voor twee verschillende eiwitten. De hoeveelheid eiwit is
afhankelijk van hoe goed de consensussequentie gelijkend is. Dit proces wordt leaky scanning
genoemd. Dit suggereert echter dat bij een lange UTR geen enkele AUG over wordt geslagen, in de
praktijk gebeurt dit echter wel.
Leaky scanning
Meerdere AUGs op een mRNA liggen vaak ook in
een ander leesraam, beiden eiwitten hebben dan
vaak ook een ander stop codon. Sendai virus
mRNA bevat 5 start codons op positie: 81, 104
(ander leesraam), 114, 183 en 201. Op deze manier
worden uit 1 mRNA 5 eiwitten gemaakt. In
humaan mRNA komt het echter zelden voor dat er
twee verschillende leesramen worden gebruikt.
2
